第10章_高效液相色谱分离检测技术.pptVIP

4.分离原理 在一定电场作用下,在毛细管中的各种不同的粒子电泳速度和电渗速度也各不相同，电渗流可以带动阳离子、阴离子和中性物质以不同的速度从阴极端流出而实现分离。 二、毛细管电泳仪的基本装置 毛细管柱、柱恒温系统、电解液槽、进样器、高压电源、检测器和数据处理器 毛细管电泳装置示意图 1．毛细管柱及温度控制 （1）毛细管柱 空心柱 ----区带电泳、胶束电泳及环糊精电泳 填充毛细管柱 ---电色谱 壁处理柱 ----蛋白质电泳 （2）毛细管恒温装置 作用---消除电泳产生的焦耳热 精度---±0.1℃ 恒温方式 高速气流恒温 液体恒温 2．高压电源 直流电源 电压:0~30kV 稳定性:±0.1% 电流强度:200~300mA 电源极性切换装置 (双极性电源) 3．毛细管电泳进样方法 流体进样 进样端加压进样 出口端真空进样 高差进样 电动进样 （瞬间高压脉冲进样) 4．电极和溶液控制系统 (1）电极----置于两侧的电泳池中铂丝电极 (2）溶液控制系统 自动进样器 分部收集器 更换缓冲液装置 缓冲液的水平系统 5．检测器 紫外-可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 质谱检测器 电化学检测器 激光类检测器 三、毛细管电泳法的模式及应用 名称 缩写 管内填充物 分离分析对象 毛细管区带电泳 CZE pH缓冲的自由电解质溶液（可含添加剂） 无机离子、有机物、对映体拆分、各种生物分子 胶束电动毛细管电泳 MECC CZE载体+带电胶束 小分子、中性分子、对映体拆分 毛细管凝胶电泳 CGE 电泳用凝胶或其它筛分介质 蛋白质、核酸、聚合酶链反应产物、寡聚核苷酸 毛细管等电聚焦 CIEF pH梯度两性电解质 等电点差异小的蛋白质、氨基酸 毛细管等速电泳 CITP 区带前后使用两种不同缓冲液 离子型化合物 毛细管电色谱 CEC CZE载体+液相色谱固定相 离子型化合物、有机物、大分子、手性化合物 非水毛细管电泳 NACE 含电解质的非水体系 弱极性、中性分子，能与质谱联用 第5节 应用案例 一、分离方法初选 二、应用案例 案例10-1 RP-HPLC法测定脂降宁片中葛根素、二苯乙烯苷的含量 想一想 1.色谱条件应包括哪些项目？ 2.本案例的色谱系统适用性验证了哪些项目? 3.测定条件如何选择? 案例10-2 大鼠生殖细胞中多胺的测定 想一想 生物样品中组分测定与药品中组分的色谱测定有哪些方面不同？ 4.4 高效液相色谱分离方式 HPLC 分离方式 液谱分离系统 液固吸附色谱 分配色谱 离子交换和离子色谱 离子对色谱 体积排阻色谱法 亲合色谱法 1、固定相（柱填料） 常用填料基质可分为硅胶、氧化物和聚合物。 硅胶是HPLC 填料中最常用的基质。它具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一 的表面化学反应等优点外，还有一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面键合或改性的基础。 缺点：在碱性水溶性流动相中不稳定。 4.4.1 液谱分离系统 目前市场主要可供选择的硅胶填料粒径 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 5.0μm － 常规分析 颗粒越小，柱效越高，但是耐污染性能下降，柱压升高。 1. 液-液分配及离子对分离固定相 （1）全多孔型担体 氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见。 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。 （2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。 表面积小，柱容量底。 4.4.1 液谱分离系统 HPLC 固定相状态分 液-固色谱法（LSC） 液-液色谱法（LLC） 分离机制分 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 化学键合相色谱法 亲合色谱法 离子色谱法 一、化学键合相色谱法 化学键合相（chemically bonded phase）将固定液（含不同官能团的有机分子）利用化学反应键合到载体表面上，使其形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相 1．键合相类型 载体-----硅胶 类型 非极性固定相 (ODS） 极性键合相 （键合-NH2、-CN、醇基等极性基团） 离子型键合相 （键合可交换阴或阳离子基团 ) 键合反应---硅烷化反应、硅酸酯化反应