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第4节 核酸的研究方法 生命科学与化学学院 安建平 教授 联系电话 8362524 　◇ 　一、核酸的分离、提纯和定量测定 　◇ 　二、核酸的超速离心 　◇　三、核酸的凝胶电泳 　◇ 　四、核酸的核苷酸序列测定 　◇　五、DNA 聚合酶链式反应 　◇　六、DNA 的化学合成 一、核酸的分离、提纯和定量测定 ◇ （一）DNA 的分离 ◇ （二）RNA 的分离 ◇ （三）核酸含量的测定法 （一）DNA 的分离 真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成核蛋白（DNP)形式存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶液（如1 mol/L 氯化钠），但不溶于生理盐溶液（0.14 mol mol/L氯化钠）。利用这一性质，可将细胞破碎后用浓盐溶液提取，然后用水稀释至0.14 mol/L盐溶液，使DNP纤维沉淀出来。使其缠绕在玻璃棒上，再溶解和沉淀多次以纯化。 用苯酚抽提，除去蛋白质。苯酚是很强的蛋白质变性剂，用水饱和的苯酚与DNP一起振荡，冷冻离心，DNA溶于上层水相，不溶性变性蛋白质残留物位于中间界面，一部分变性蛋白质停留在酚相。如此操作反复多次以除净蛋白质。将含DNA的水相合并，在有盐存在的条件下加2倍体积冷的乙醇，可将DNA沉淀出来。用乙醚和乙醇洗沉淀。用此方法可以得到纯的DNA。 用氯仿一辛醇（或异戊醇）与DNP溶液振荡，借助表面变性除去蛋白质，反复多次直至得到不含蛋白质的DNA。此操作过程与苯酚法相似。 为了得到大分子DNA，避免核酸酶和机械振荡对DNA的降解，在细胞悬液中直接加入2倍体积含1% （SDS)的缓冲溶液，并加入广谱蛋白酶（如蛋白酶K)最后浓度达100ug/mL，在65℃保温4h，蛋白质全部降解，然后用苯酚抽提，除净蛋白酶和蛋白质的部分降解产物。DNA制品中的少量RNA可用纯的RNase分解除去。此方法现在比较常用。 氯化铯密度梯度离心（cesium chloride density gradient centrifugation）也是实验室制备高质量DNA常用的方法。 （二）RNA 的分离 RNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在，因此RNA的分离更为困难。制备RNA通常需要注意3点： ①所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能高压灭菌的用具要用0.196焦碳酸二乙酰（DEPC）处理，再煮沸以除净DEPC。 DEPC能使蛋白质乙基化而破坏RNase活性。 ②在破碎细胞的同时加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活。 ③在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin) 。 目前最常用的制备RNA方法有两个： 其一，用酸性胍盐／苯酚／氯仿抽提。 异硫氰胍是极强烈的蛋白质变性剂，它几乎使所有遇到的蛋白质都被变性。然后用苯酚和氯仿多次除净蛋白质。此法用于小量制备RNA。 其二，用胍盐／氯化铯将细胞抽提物进行密度梯度离心。蛋白质密度 1.33 g/cm3,在最上层。DNA密度在1.71 g/cm3左右，位于中间。RNA密度 1.89 g/cm3，沉在底部。用此方法可制备较大量高纯度的天然RNA。 分离poly(A)十mRNA通常采用寡聚胸腺嘧啶核苷酸(oligo (dT)，）亲和层析法。用寡聚（dT)纤维素柱或寡聚（dT）琼脂糖凝胶柱吸附mRNA，洗涤后用低离子强度缓冲液回收mRNA，得到较高质量的制品。 不同功能RNA常分布于细胞的不同部位，分离这些RNA常需先用差速离心法，将细胞核、线粒体、叶绿体、胞质体等各部分分开，再从这些部分中分离出RNA. （三）核酸含量的测定法 1.紫外分光光度法 ◇ 2.定磷法 ◇ 3.定糖法 ◇ 4.生物材料的处理 2.定磷法 磷的测定最常用的是钼蓝比色法。此法需先用浓硫酸或过氯酸将有机磷水解成无机磷。在酸性条件下正磷酸与钼酸作用生成磷钼酸，在还原剂存在下被还原成钼蓝，其最大吸收峰在660 nm处，在一定范围内溶液光密度与磷含量成正比，据此可以计算出核酸含量。 3.定糖法 定糖法常用的也是比色法。当RNA与盐酸共热时核糖转变为糠醛，它与甲基苯二酚（地衣酚）反应呈鲜绿色，最大吸收峰在670 nm处，反应需要三氯化铁作催化剂。DNA在酸性溶液中与二苯胺共热，其脱氧核糖可参与反应生成蓝色化合物，最大吸收峰在595nm处。此外，还有一些比色反应也可给出灵敏的结果。 4.生物材料的处理 细胞或组织中核酸含量的测定需要先对生物材料作一定的处理，以便定量提取出核酸的成分。组织预先处理的目的是除去酸溶性含磷化合物及脂溶性含磷化合物。常用冷的5%～10%过氯酸(PCA)或三氯乙酸（TCA）处理粉碎的