第3章 细胞生物学研究方法.pptVIP

二、电子显微镜 electron microscope EM (一) EM的基本知识 4.电镜三维重构 three-dimensional restrcture 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的新技术。适应于分析膜蛋白、病毒、蛋白质-核酸复合体的三维结构。 原核细胞，培养方便，生长快，基因结构简单，突变株的诱变，分离和鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。 细胞生物学常用的模式生物（一）大肠杆菌 （二）酵母 单细胞真核生物的代表：芽殖酵母和裂殖酵母，生长迅速并且易于遗传操作 常用于白质相互作用、细胞周期、基因表达调控、膜泡运输、细胞分化和衰老等 （三）线虫(Caenorhabditis elegans) 遗传背景清楚、生命周期只有3天，成体只有959个细胞，通体透明，便于胚胎发育中细胞分裂、分化以及细胞的死亡的研究 （四）果蝇(Drosophila melanogaster) 基因组序列已测定，与人类基因有很高的同源性，在遗传分析、染色体特性研究、胚胎发育的基因调控和细胞分化机制的研究、神经退行性疾病和学习、认知等领域的研究发挥重要的作用 （五）斑马鱼(Danio rerio) 小型脊椎动物。它的许多基因与人类的基因存在对应的关系 3 个月性成熟、产卵多、胚胎体外发育，利于研究胚胎发育过程中细胞行为 （六）小鼠(Mus musculus) 小型哺乳动物，遗传背景清楚，进化方面最接近人类，用于转基因小鼠、基因打靶、条件基因打靶、RNA 干涉以及疾病模型 （七）拟南芥(Arabidopsis thaliana) 十字花科的植物， 广泛用于植物遗传学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学的研究 二、突变体制备技术 在RNA 水平: RNA 干扰的方法 在DNA 水平: 基因敲除(knock out) 基因敲除技术在小鼠中的建立与应用为动物功能基因学和人类疾病小鼠模型作出了重要贡献 三、蛋白质组学(proteomics)技术 是全面研究细胞、组织乃至整个生命体内蛋白质组成及其活动规律的科学 蛋白质组学技术主要包括蛋白质分离技术(双向凝胶电泳、多维液相色谱、毛细管电色谱等)、蛋白质鉴定技术(如质谱、蛋白质芯片技术等)和生物信息学分析 Thanks for yourattention! Cyan Fluorescent Protein 蓝色荧光蛋白CFP或 blue fluorescent protein 。 应用超薄切片技术，几乎可以观察各种细胞的超微结构 2.负染色技术 negative staining 观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等 重金属盐(磷酸钨或醋酸双氧铀)对铺展在铜网上的样品进行染色，而样品未被染色(故名负染) 3.冷冻蚀刻技术 freeze etching 又称冰冻断裂－蚀刻复型技术，观察膜断裂面上的蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感，样品不需固定包埋。 低温电镜技术样品不经固定、染色和干燥，直接包被在冰膜中，在电镜内-160 ℃低温下利用相位衬度成像 研究细胞和细胞器三维精细结构的电子扫描断层成像技术 低温电镜技术 cryoelectron microscope 5.扫描电镜技术 scanning electron microscope SEM 利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出的二次电子成像，可以得到样品表面的立体形貌 Figure 9-49 (Molecular Biology of the Cell (? Garland Science 2008) 为了保证样品在扫描观察前不发生表面变形，通常需要利用CO2 临界点干燥法对样品进行干燥处理 样品在观察前还要喷镀一层金膜，以获得二次电子信号 一、超离心技术分离细胞组分 差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种质量和密度不同的亚细胞组分和各种颗粒分开。 密度梯度离心：通过离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不同的沉降带 第二节 细胞及其组分的分析方法 二、细胞成分的细胞化学显示方法 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量。 DNA的细胞分布——Feulgen法，DNA呈紫红色。 RNA的细胞分布——Brachet法，RNA染成红色，DNA呈蓝绿色。 碱性磷酸酶——Gomori的钙—钴法，碱性磷酸酶染成黑色。 多糖——PAS反应（过碘酸—Schiff反应），多糖染成紫红色或品红色。 不饱和脂肪酸——四氧化锇，不饱和脂肪酸染成黑色。 福尔根反应 定性细胞中酶时，样品制备常采用冰冻切片，或以冷丙酮、甲醛进行短时间固定，以尽量保持酶活性 三、细胞内特异蛋白抗