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第2章 遗传图绘制 基因组计划基本目标是获得全基因组顺序，在此基础上再对序列进行解读。获取基因组顺序的主要方法是进行DNA测序，然后再将读取的顺序组装。目前的DNA测序每次反应仅能读取不到1 000bp的长度，已知最小的细菌基因组为580kb。因此基因组测序的第一步是构建基因组图，然后将基因组区段分解逐个测序，最后进行组装。基因组作图的基本构想是，在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记，根据分子标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位，绘制基因组图。一旦构建好基因组图，即可着手进入全基因组测序。以基因组图指导的测序有二种可供选择的路线(图2.1)： 克隆(clone)定义 一个共同前体通过无性繁殖而形成的一群基因结构相同的细胞或个体。(组培) 基因克隆，则指一个基因反复扩增后产生的多个拷贝。 动名词(cloning)即指获得克隆的过程或手段。 利用体外重组技术将某特定的基因或DNA序列插入载体分子的操作过程。 1. 重叠克隆群法 构建过程： DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化。先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群” (contiguous series of overlapping clones, Contig)。这些重叠克隆群之间往往是有间隙的，需通过染色体步行(chromosome walking)的方法将这些克隆群整合在一起。在单个的重叠群中，采用鸟枪法测序，然后在重叠群内进行组装。这是一种由上至下(up to down)的测序策略。 2. 鸟枪法(shotgun sequencing method)将目的DNA随机地处理成大小不同的片段，再将这些片段的序列连接起来的测序方法。高密度的基因组图分子标记可以检测组装的DNA片段是否处在正确的位置，并校正因重复顺序的干扰产生的序列误排。这是一种由下至上(bottom to up)的测序策略。 基因组图的绘制可为基因组的全面测序提供工作框架。由于一些分子标记同基因座位紧密连锁，同时为靶基因的定位克隆提供了可能。根据靶基因所在基因组图中的位置，可以尽快地获知重要基因的顺序。正是基于这些理由，人类基因组计划最初6年的工作重心主要放在人类基因组图绘制。 2.1 遗传图与物理图 根据采取的方法不同将基因组作图分为两个范畴： ①遗传作图(genetic mapping) 采用遗传学分析方法将基因或其他DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验和家系分析。遗传图距单位为厘摩(cM)，每单位厘摩定义为1%交换率。 ②物理作图(physical mapping) 采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。物理图的距离依作图方法而异，如辐射杂种(radiation hybrid)作图的计算单位为厘镭(cR)，限制性片段作图与克隆作图的图距单位为DNA的分子长度，即碱基对。 2.2 遗传作图标记 任何一类图谱都有可识别的标记，以便寻找目标的方位及彼此之间的相对位置。遗传图有特征性的位置标记用表示基因组中特定顺序所在的位置。 2.2.1 基因标记 经典遗传学研究一种性状的遗传必需要求同一性状至少有二种不同的存在形式或称表型。如孟德尔研究豌豆植株高与矮这种相对性状，每个相对性状都有一个不同的等位基因(allele)控制。最初人们识别的指令表型的基因都是通过肉眼观察辨认的，如果蝇躯体的颜色，翅膀形状等标记都可在低倍显微镜下或直接用肉眼进行分辨。这些研究虽然在遗传学发展的早期阶段取得了很好的结果，但很快遗传学家即意识到可见的表型性状数目十分有限，尤其是当多个基因影响同一性状时，遗传分析往往陷入困境。为了使遗传图具有更强的综合性，必需发现大量易于区分的、较为单一的性状，具有生化特征的表型具备上述要求。微生物如细菌及酵母遗传学研究中，依赖于生化表型的分析，已将一些生化性状基因进行作图。人类血型系列(ABO)分析，血清蛋白和免疫蛋白(人类白细胞抗原，HLA)变异研究都是利用生化的表型。这些生化特征较之可见表型的最大优点在于：它们属于多等位基因(multiple alleles)。例如HLA-DRBI (human leukocyte antigens-DRBI，人类白细胞抗原DRBI)基因位点有至少59个等位基因，HLA-B位点至少有60个等位基因。 2.2.2 DNA标记 虽然基因标记非常有用，但并非理想的标记。原因之一是，高等生物如脊椎动物和显花植物，可用作标记的基因十分有限，许多性状都涉及多基因。此外高等生物基因组