5质粒的提取和电泳.pptVIP

* 置-20℃沉淀15-30min放映：温度控制系统。 * 提完质粒午休 * 重组质粒的酶切加样：20 分钟（8：15~8：35）； 酶切45分钟（8：35~9：20） * 电泳上样：20分钟（9：20~9：40）；电泳时间：40分钟 （9：40~10：20） 观察昨天实验课的结果 1、观察自己组的实验结果：转化平板 *培养板在37C 培养12-16h 卫星菌：培养时间过长 2、实验中的难点 *制备效率高的感受态细胞 重组质粒的鉴定 平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞 提取的质粒 质粒电泳筛选重组质粒 重组质粒的进一步酶切鉴定 如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？ 平板筛选： 大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞 提取的质粒 质粒电泳筛选重组质粒 重组质粒的进一步酶切鉴定 小量制备质粒和电泳分析 质粒…… 质粒载体 是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状 筛选标记 MCS（多克隆位点） 复制原点 质粒 1)培养细菌使质粒扩增； 2)收集裂解细菌； 3)分离纯化质粒DNA。 质粒提取原理： 质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤： √去除蛋白质 √去除基因组DNA √去除RNA *酚-氯仿抽提法 *RNase消化 ？？？ 质粒DNA与基因组DNA的区别 大肠杆菌遗传物质 1、部位不同： 2、大小不同： 质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体DNA的百分之一。 基因组DNA分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5?106 bp。 基因组DNA容易断裂线性化 提取的质粒的方法： 特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提） 测序、转染（细提） 1. 小量碱裂解法 2. 质粒提取试剂盒 纯化原理：离子交换柱层析等 小量制备质粒kit 大量制备质粒kit 去除内毒素制备质粒kit 质粒提取试剂盒可用于大部分分生实验， 本次试验不进行实验操作，只讲解结果分析。 碱裂解法提取质粒的原理 原理： 1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。 2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除； 3、怎样去除蛋白质？ （已经学过） 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA. 1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0 10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0 2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体 0.2mol/L NaOH 1% SDS 碱裂解法提取质粒试剂： 3）中和液（溶液III） ----中和NaOH 60 ml 5mol/L 醋酸钾 11.5ml 冰醋酸 28.5ml 水 4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 ? g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。 质粒DNA的制备 （1）（细菌的收获：） 取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。 （2）（细菌的裂解：） 加入200?l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌 加入200?l细菌裂解液（溶液II）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。 注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。 （3）（中和：）加入150?l中和液，上下颠倒混合后置 冰上 5min， 12,000转/分， 4℃离心 5min。 碱裂解法提取质粒操作步骤 （去除蛋白质） （4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,00