第5讲核酸电泳.pptVIP

19世纪初(1808)发现了电泳现象。当时多用于胶体化学的分析 1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白呈4-5高峰即界面电泳 1948年 Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化 近30年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术 （一）电泳的分类： 1、按分离原理分为： 自由电泳 如：显微电泳 区带电泳 稳态电泳（置换电泳）：如等电聚焦和等速电泳 特点：分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态 2、按有无固体支持物分类 a、按其支持物的物理性状不同可分为： 1)凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉 凝胶电泳 2)滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸纤维膜、聚胺纤维薄膜 3)粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 4)线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳 b、按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： 1)平板式电泳：最常用，支持物水平放置 2)垂直板式电泳：例如，垂直板聚丙烯酰胺凝胶 3)垂直柱式电泳：例如，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳 3、按pH的连续性不同，区带电泳可分为： (1) 连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如 常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等 (2) 非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同 的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳，等电聚焦电泳等 4、按电泳时的电压分为： 高压电泳 电压： 500-1000V 电位梯度：50-200V/cm 特点：分离速度快，但热效应大，需冷却装置 主要适合于小分子化合物的快速分离 常压电泳 电压：500V以下 电位梯度：2-10V/cm 特点：分离速度慢，但对设备要求不高 医学、检测、普通科研上常用 1、纸电泳 主要用途：分辨率比凝胶介质差，但由于操作简单，现在仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途 2、醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜作为支持介质 3、梯度凝胶电泳 采用梯度聚丙烯酰胺凝胶为介质，从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度递增（凝胶的顶部孔径较大，底部孔径较小）。 4、等电聚焦电泳 等电聚焦电泳：根据两性物质等电点（pI）不同而进行分离的一种电泳技术，具有极高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离蛋白质等两性物质的一种理想方法 分离原理：是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个不连续的pH梯度，两性物质在电泳过程中会自动集中在与其等电点相应的pH区域内，从而得到分离 5、毛细管电泳 一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力，根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术 发展于20世纪80年代中后期，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使细胞分析，乃至单分子分析成为可能 毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是： (1)所需样品量少、仪器简单、操作简便； (2)分析速度快，分离效率高，分辨率高，灵敏度高； (3)操作模式多，开发分析方法容易； (4)实验成本低、消耗少； (5)应用范围极广 6.1 不同类型琼脂糖的性质 6.3 不同类型琼脂糖的分辨率 B、凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称 其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号 6.5 凝胶中DNA谱带的成像 6.8 三种常用电泳缓冲液及其特点：TAE(Tris-乙酸)、TPE(Tris-磷酸) 及 TBE(Tris-硼酸) 7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 在聚丙烯酰胺凝胶中加入适量十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)或尿素，或SDS-尿素后，用其作支持物进行(分离检测大分子样品)的凝胶电泳。 2)非变性聚丙烯酰胺凝胶（native） （迁移率受其碱基组成和序列的影响） Native与SDS的区别： 7.3 DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。