荧光光谱仪的使用.pptVIP

岛津荧光光谱仪RF-5301PC 处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。 不同类型的发光 最普通的是荧光. 如果当 一个物质吸收一定波长的光然后给出较长波长的光称为荧光. 一些油漆、纸张具有荧光特性. 其次是磷光. 当一种物质吸收光，然后再发出光称为磷光.如果磷光物质暴露在阳光下，然后再带到暗室内,给出的光称为磷光. 化学发光：当 2 种化学物质混合后给出的光. 萤火虫发光是一种生物发光.萤火虫会产生.荧光素酶，导致发光. 类似化学发光，两种生物化学物质混合产生光. 分子吸收、荧光、磷光辐射跃迁 无辐射跃迁——去活化过程 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 。这些过程包括： 1）振动弛豫 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 2）内转换 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。 定性分析 任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。 1）激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。 激发光谱与发射光谱的关系 i）波长比较 与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。（振动弛豫失活所致） ii）形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激到可到达不同能级的激发态，但由于去活化（内转换和振动弛豫）到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。 换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。 测量过程 激发光谱告诉我们什么？ 激发光谱 发射光谱告诉我们什么？ 化合物荧光波长 荧光强度 拉曼和瑞利散射 发射光谱 哪些峰不是样品峰 瑞利散射 激发波长峰 发射和激发相同波长的峰 拉曼散射 溶剂发射波长(documented) 与激发波长相差固定频率的波长 2次或3次光 发生在激发波长的2倍或3倍波长处? 瑞利散射 颗粒的大小小于入射光的波长. 光通过样品后频率不变.由于弹性碰撞不存在能量的转移.光线只是简单地改变方向，波长不变. 粉末、悬浮液等样品. 拉曼散射 样品吸收和发射光并伴随有能量转移的产生. 光通过样品后光的波长、频率发生了改变. 与入射光相比发射光的频率可能更高或者更低. 瑞利、拉曼散射和2次光 外来峰的校正 截止滤光片去除2次、3次等高次光 差谱法去除拉曼和瑞利散射峰 用高纯溶剂 (无荧光) 扫描溶剂确定拉曼峰 维持测定温度与条件 定 量 荧光强度与浓度的关系 标准表与标准曲线  荧光分光光度计 原理和结构 荧光分光光度计示意图 荧光应用领域—生命科学 荧光应用领域—食品科学 荧光应用领域—化学、环境科学 样品形态 液体 Cell suspensions Transparent solutions 固体 Powders Cells mounted on slides Often it is difficult to interpret the emission spectrum of an unknown. As mentioned earlier, there are several peaks and some of them are not sample related. The Rayleigh scatter and 2nd and 3rd order peaks are the easiest to find. The Rayleigh peak will be at the excitation wavelength when you scan through that wavelength with the emission monochroma