蛋白质层析技术课件.ppt

蛋白质层析技术;蛋白质层析介质 蛋白质层析技术  蛋白分离纯化平台 及单抗的分离纯化;蛋白质层析的原理和要点;层析的概念;层析一般地是一种物理方法;液相层析;蛋白液相层析的应用;蛋白液相层析的构成;蛋白液相层析的一般程序;样品制备;分离纯化机制;蛋白质层析介质基体须具备的特性;结构:典型层析介质的放大观察;化学组成:亲水多孔高聚物等;聚合物基体(matrix)孔的结构;孔的结构可分为三种类型;基体孔结构决定传质特点;动态载量（Dynamic Capacity）;层析介质颗粒度与动态载量;吸附动力学与动态载量;从动态载量看上样条件;吸附蛋白的大小与动态载量;柱效依赖于层析介质对样品的选择性和分离带宽. 在多孔颗粒介质的柱子中带宽或柱效表示为： H =2?d+B/V+Cmd2V + Csd2V;柱效 (H) vs 流速(V) ;塔板高度 分辩率;不同吸附机制的洗脱峰宽与流速;1) Thyroglobulin 2) Gamma-globulin 3) Beta-globulin 4) Cytochrome C;分析 5-10 μm beads 1-20 ml columns High operating pressures, (80 psi) 半制备 20-30 μm beads 20-500 ml Medium operating pressures (30-100 psi) 制备型层析 40-200 μm beads 20 ml-1000 liters Low to medium operating pressures (5-50 psi);分离机制选用策略;分步洗脱还是梯度洗脱？;几步完成纯化？;综合考虑样品的各种性质;设计合理的方案;IgG样品中蛋白酶的降解作用;阳离子交换与DNA污染;同样的起始样品不同的纯化方案;生物大分子液相层析仪;蛋白质液相层析有其特殊性-生物相容性和化学稳定性 对层析仪有与小分子物质液相层析不同的要求 液相层析仪已是非常成熟的设备;液相层析仪的基本结构;输液泵——注射泵;输液泵——恒压泵;输液泵——双柱塞泵;不同泵的输液特性;液相层析仪的特性;二元梯度;四元梯度;层析仪的核心是输液泵;更换泵头技术;单柱塞单泵低压混合——Waters 650系列 双柱塞单泵低压混合——BioCAD 单柱塞双泵高压混合——Gilson，Beckman 双柱塞双泵高压混合——HP, Bio-Rad, APB AKTA;检测器;目前常见的几种检测器;分部收集器;多种收集架可供选择;用各种阀提高自动化程度;软 件;;;;; Trace Compare Overlay ;几种蛋白层析仪的综合比较;有关蛋白层析仪的几种错误观念;蛋白质纯化平台;引言;生物技术(Biotechnology)有三大部分：生化分离技术；DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离技术是生物技术的基础和支柱。 层析(chromatography)是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。 基因工程下游的核心是层析。 层析技术的理论与实践已高度发展和完善。;蛋白质纯化平台将成为分子生物学实验室的基本内容;生化学家分离未知蛋白;基因工程下游分离已知蛋白 ;分子生物学实验室需分离已知蛋白; 蛋白质纯化平台的结构和组成 ;分离机制;纯化平台的硬件结构 ;层析柱;经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开；6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的蛋白。 通常，3000个塔板如用Bio-Gel P(fine)或Bio-Gel A(fine)，流速20cm/h（参照产品说明书） 应在80cm以上至120cm，上样5%，一般1-2%。 Scope建议： 柱直径：D=(M/10)1/3 D:cm； M:蛋白量（mg） 而L=30D L：cm;实验室规模的层析应采用不大于50?m的离子交换或疏水介质，应具有10cm左右，则不少于600个理论塔板。 精制：高效预装柱1- 5ml，10?m左右粒度，如Mono系列；Bio-Scale；TSK等。;平台的操作（软件：知识结构） ;E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因不要使用超声破碎法。 0?C ，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含2.5mMEDTA 高渗后，加入低渗液，迅速充分悬浮。如果必要，应含DTT至2mM左右。 均浆液组成原则：离子强度尽量低：?50mM，有时需DT