质粒的酶切—琼脂糖凝胶电泳分离DNA.pptVIP

实验二 质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分离DNA 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 实验目的 限制性内切酶切割出目的DNA 了解琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法 实验原理 利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。 琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围很广。 pBC SK map 它的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。 实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 水平式凝胶电泳槽 2. 稳压电泳仪 3. 电炉 4. 紫外检测仪 5. 台式离心机 （二） 材料 实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。 （三） 试剂 1.限制性内切酶 EcoRI， 2. TAE电泳缓冲液(50×) （pH8.0） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 3. 溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 4. 10×DNA样品上样缓冲液 5. 琼脂糖 实验步骤 酶切体系 调制酶切体系如下: (共 20μL) 无菌水 6μL， 质粒 10 μL Buffer K 2μL, EcoR I 1μL, BamH I 1 μL 37℃酶切1.5小时。 琼脂糖凝胶制备 1. 洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。 2. 插好挡板、梳子。 3. 根据实验所需称取0.4克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml电泳缓冲液（1×TAE）。 4. 加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。 5. 溶液冷至约60℃时，加入溴化乙锭4 μL (终浓度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。 6. 室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。 7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。 8.在DNA样品中加入2 μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。 9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。 10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。 11. 等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。 12. 取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。 13.. 根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4℃保存，以备下周实验用。 实验结果及讨论 质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。 如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散。 影响RE(限制性内切酶)活性的主要因素：DNA的纯度；DNA的甲基化程度；温度；缓冲液成分（DDT，BSA）等。 使用3 mg的DNA Marker DL　2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。