生物分离工程第三章.pptVIP

3 初级分离;初级分离特点; 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。;沉淀法; 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：;沉淀法操作步骤 ;沉淀法的分类;3.1.1 蛋白质的表面特性;蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。 ;蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域;防止蛋白质凝聚沉淀的屏障;蛋白质胶体溶液的稳定性;蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似;3.1.2 盐析沉淀; Cohn方程式;Cohnx 经验式（用浓度代替离子强度）;用盐析法分离蛋白质的二种方法;虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。;盐析操作;加盐方式;用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即秒为该蛋白盐析的饱和度。饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。 ;1．饱和硫酸铵溶液法???在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已??盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量：  ????????????????????????????????????????????式中：?? ???????????V0——蛋白质溶液的原始体积； ???????????C2——所要达到硫酸铵饱和度； ????????????C1——原来溶液的硫酸铵饱和度； ????????????V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。 将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋白质溶液中，即可达到盐析的目的。严格讲，混合两不同溶液时，混合后的总体积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上式中是按相等于计算的，所以会产生误差。但实验证明所造成的误差一般小于20%，故可忽略不计。 ;2．固体硫酸铵法???所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量： ;现考虑向1dm3蛋白质溶液中加入硫酸铵至某一浓度使蛋白质发生盐析操作。由于加入硫酸铵后溶液的体积增大，在20℃下，硫酸铵的摩尔浓度从Ｍ１增大到Ｍ２所需加入的硫酸铵量（克）可由下式计算;上式如以饱和度表示，则从S1%增至S2%，需加入克数为上式 上式还可以列成表，更为方便。 实际所需 (NH4)2SO4的饱和度，需通过试验决定。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mg／L，通常兼顾收率与纯度。;典型的硫酸铵盐析过程最适饱和度是35%~55%;阴阳离子盐析效果;盐析注意事项： （1）稳定pH用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度 ;3.1.3 等电点沉淀;图3.6 表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。;（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH敏感，易失活 （5）在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。 ; 酶、蛋白质、核酸、多糖类生化物质的水溶液中加入乙醇、丙酮等水溶性的有机溶剂，它们的溶解度会显著降低，从溶液中沉淀出来。 有机溶剂沉淀的优点是：分辨率比盐析法高，溶剂容易除去并可以回收。缺点是易使酶变性。 ; 加入有机溶剂使溶液的介电常数减小，增加酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作