基因组文库的构建与应用研究进展.docx

一.基因组文库的构建和应用研究进展 随着后基因组学时代来临，克隆、研究并利用生物的重要基因、研究它们的 结构、功能和进化己经成为遗传学领域的热点之一。和原核生物相比，真核生物 基因组结构复杂，研究起来较为困难。随着大片断DNA克隆技术的发展核完善, 构建真核生物大片断DNA的基因组文库，并以之为平台进行基因组序列测定、 物理作图、基因分离、以及基因结构核功能的分析等研究，已经成为真核生物基 因组研究中行之有效的方法⑴。 基因组文库是指含有某种牛物全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。 这个文库象是一个贮存有基因组全部序列的信息库，故称为基因组文库(genomic library),又称为人工构建的基因“活期储蓄所” (genomic bank)。人们既可以通 过基因组文库的构建、贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，同时又能 够在必需时从基因组文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因⑵。 1基因组文库的产生和发展 克隆载体作为基因组文库构建的重要媒介，提高其容纳量一宜是重要发展方 向之一。自1973年Cohen构建了第一个质粒载体pSIOl以来，越来越多的克隆载 体相继岀现，使得克隆载体的整体结构和克隆效率有了很大改善。载体的发展大 致经过三个阶段:第一代是以入噬菌体和粘粒为代表的载体；第二代的代表为YAC (yeast artificial chromosome) BAC (bacterial artificial chromosome ) 及PAC (Pl-derived artificial chromosome)；第三代为 BIBAC (binary BAC)及 TAC (transformation -competent artificial chromosome)为代表的新型文库载体，不仅 具有第二代载体的所有特征，而且具备了植物的转化功能⑶。 入噬1. 1第一代载体 入噬 体是最早使用的克隆载体，其插入片断仅20 kb左右⑷。1979年Royal 等确定了在粘粒(Cosmid)载体中克隆大片断的可能性⑸。此后粘粒载体用于构 建果蝇、小鼠、人等基因组文库，并从这些文库中成功分离得到基因。肺炎支原 体基因组全序列的测定就是粘粒文库的基础上完成的?铁粘粒是用包含九噬菌体 cos位点的质粒。载体长4?6 kb,平均插入一般为40 kb左右。重组的粘粒可承载 外源DNA片段，并象入噬菌体一样感染大肠杆菌，在细菌细胞中复制和增殖。粘 粒载体优点在于稳定性好，嵌合体少。缺点是插入片断过小，若用于染色体步行 (chromosome walking)则所需步彳亍次数太多，很大程度限制了它的应用。 1 ? 2第二代载体 第二阶段的克隆载体与第一代载体相比，显著特点是载体的容载能力扩大。 酵母人工染色体YAC是最早发展的真止意义上的人工染色体，具备在寄主细胞 中稳定地复制和遗传所必须的三个元件：复制起始区(origin of replication),参 与染色体DNA复制起始结构的形成；着丝粒(centromere),负责染色体向子细 胞的传递；端粒(telomere),对染色体DNA两个末端起封口和保护作用⑼。酵 母人工染色体的平均插入片段可达到1 Mb左右，因此构建基因组文库时，只需 要较少的克隆数便可以覆盖整个基因组。因此YAC很快成为构建复杂基因组 DNA文库的主要载体系统。在人类基因组计划的早期，YAC文库被用于基因组 框架的构建“叭 虽然YAC能容载较大的片段，但同吋也有一些自身难以克服的缺点：一是 嵌合现象的存在。即一个YAC克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片段, 嵌合体的比例达到40 %?60 %,这种现象使染色体步行和基因分离难度加大； 二是YAC克隆的稳定性差，插入片段存在重排(sequence rearrangement)和丢失 (insert deletion)现彖，这对染色体物理图谱的构建和基因分离都十分不利；三 是插入片段的分离和纯化困难；四是不能采用电转化，转化效率低。这些缺点限 制了YAC的应用llu ,2JO因此科学家开始把眼光转向寻找更好的载体系统。1992 年BAC载体应时而生口。 细菌人工染色体(BAC)是以大肠杆菌致育因子(F因子)为基础的合成载 体。F因子具有稳定遗传的特点，其复制是严谨型的，在每个细胞屮仅有1?2个 拷贝，减小了插入片段发生重组的机率，理论上F因子能够携带1 Mb的外源片段, 在实际应用中克隆的平均大小约为120 kb,个别BAC重组子中含有的基因组DNA 最大可达300 kbo虽然容量没有YAC载体大，但BAC载体拥有YAC载体所缺乏而 科学家所需的多个优点：一是以大肠杆菌为寄主，采用电转，转化率高，因此构 建BAC文库比YAC文库更容易；二是BAC载体以