目的基因的获取课件.pptVIP

目的基因的获取;1、什么是目的基因 2、目的基因获取途径 3、PCR法制备方法及过程;一、什么是目的基因 目的基因：是指基因工程操作中需要的外源基因，它是编码某种蛋白质的结构基因， 如生物的抗逆性基因、抗虫基因等。 从目的基因的概念来看， 最原始的目的基因是指从某甲种生物体内直接获得， 然后转入已知的某乙种生物体内并让其成功表达以使乙种生物能表现甲种生物的某种特征的基因。 ;;二、目的基因的获取;三、PCR扩增获得目的基因;1、PCR的含义 ;PCR 可以把 指定的基因片段 几何放大;2、PCR的基本原理;3、PCR的反应过程;2）、变性：使DNA双链解离变为单链。一般94℃～95℃，1min足以使模板变性 若低于94℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。;3)、退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温度是影响PCR特异性的重要因素。 退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 ℃之间。 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想。;引物的复性温度的计算公式;4）、延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则不断合成DNA片段。延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10kb需延伸至15min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些;4、PCR的反应过程演示;;;;;;;;;;5、PCR法克隆基因的技术流程;5.1 设计引物;（6）引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）， 5’端无严格限制。 （7）引物5′端可修饰 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响。; 限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记;5.2 提取基因组DNA;5、3 进行PCR反应;5、4 PCR反应体系与流程;5、5进行电泳检测;谢谢！