免疫共沉淀-研究生实验课演示教学.pptVIP

免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）;背 景;实验目的;;;;人脑微血管内皮细胞培养于直径为6cm的培养皿，培养大约90%以上融合后，倒掉培养液，PBS洗3次； 加入1ml Lysis Buffer（20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1%TritonX-100, 1mM β-Glycerolphosphate, 1mM Na3VO4, Cocktail proteinase，pH 7.5），冰上放置30min，裂解细胞；;采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件不一样，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)。 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。 Na3VO4作用为保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。因此在做磷酸化的信号转导时需添加。 ;将裂解液转移至EP管中，4℃转鼓摇15min ，14000g 4℃离心15min ； 吸取上清液到新EP管中，每管加1μg 对照兔IgG，同时加入Protein A agarose，4℃转鼓转30min，4℃ 10000g 离心5min； preclear及其作用 一抗和相应来源的normal mouse, rat, rabbit or goat IgG中有相同或相似的成分(如无关IgG) , 用一抗相应来源的IgG与蛋白裂解液和protein A－agarose可以去除一抗中无关IgG对蛋白裂解液中物质的非特异吸附, 二是可以去除蛋白液中与protein A－agarose非特异结合的物质。做 preclear 的IgG 是不针对特异性抗原的。 琼脂糖珠的选择 SEPHAROSE是注册商品名, 本身是agarose做的凝胶。 ;转移上清液至一新管中，将每管总蛋白定量至500-2000 (250-1000) μ g，用lysis Buffer将体积补齐至600-800 μ l。加入AKT兔抗人多克隆抗体10 μ l，4℃ 转鼓过夜(10min)； 孵育液体积的控制：考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲液太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。 加入35 μl Protein A agarose，4℃转鼓转2h (10min) ； 1000g 4℃ 离心5min，PBS洗3次，加入40μl 2×SDS Sample Buffer（125mM Tris?Cl pH6.8, 4%SDS, 20%Glycerol, 100mM DTT, 0.02%溴酚蓝）沸水浴中煮沸5min； Western Blot检测样品，剩余样品-20℃保存。 ;抗体的选择： 1. 使用明确的抗体：实验最需要注意的就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免疫细胞化学染色能???合未必能用在IP反应。仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题，确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生； 2.使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 3. 抗体用量的控制：1-4μg（通常用2 μg ） 4. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。;优 点;缺 点;;结果分析;2. 过表达血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作用），同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，也可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用。 3. 不添加NP40一类表面活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。 通常IP体系中NP40含量0.2-0.5%。 NP40在0.5-1.0%时，染色体很容易析出，造成样品过粘而需要超声。;4. 超声和冻融的影响 很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱的相互作用）。 但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用。 5. Tag的影响 His-tagged主要用于纯化蛋白。用His-tagged蛋白进行coIP存在潜在的隐患。因为很多蛋白会有富含histidine的domai