重组DNA技术简介.pptVIP

资料分析 此例子实现了哪种生物的哪些性状在另外哪种生物中表达？ 性状的表达与我们从前学过的什么过程有关？ 要实现人的乳蛋白基因在牛中表达，要提前做哪些关键工作? 基因工程(genetic engineering) 所谓基因工程(genetic engineering)就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。 基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。 1.1 DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） ——限制性内切酶 DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） ——DNA连接酶 基因转移工具（“分子运输车”） ——基因进入受体细胞的载体 限制性内切酶 运载体——就是要将目的基因导入到受体细胞中 选择什么作为基因进入受体细胞的载体 运载体满足什么条件？ 作为载体的必要条件 能自我复制 有切割位点 能与目的基因结合 能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复 制并表达； 有遗传标记基因 对受体细胞无害、容易分离 比较容易得到 练习 在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶 基因工程常用的受体细胞有（ ） (1)大肠杆菌 （2）枯草杆菌 （3）支原体 （4）动植物细胞 A. （3）（4） B. （1）（2）（4） C. （2）（3）（4） D. （1）（2）（3） PCR(多聚酶链式反应) 载体的特点 3、 PCR原理 ①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 多聚酶链式反应扩增DNA片断 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化 4、 Taq DNA聚合酶的应用 5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 6、 PCR技术的特点 7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 缓冲液 细胞内环境 反应环境 外源加入 细胞内源 聚合酶 外源加入 细胞内源 底物dNTP 外源加入 引物合成酶 引物 外源加入 细胞内源 模板（母链） 体外的模拟 体内DNA的复制 ① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸 8、细胞内复制和PCR不同点 ② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 （五） PCR的反应过程 1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸 ①变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备 2、循环过程 靶序列 靶序列 PCR 循环第一步 ：加热变性 ②复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 靶序列 靶序列 引物 Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火 ③延伸 DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链 靶序列 靶序列 引物Ⅰ 引物Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ Taq DNA 聚合酶 PCR 循环第三步 ：引物延伸 靶序列 靶序列 第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列 1,048,576 20 1,073,741,824 30 8 3 4 2 2 1 DNA数量 循环次数 3、30次循环后靶序列扩增的数量 4、PCR 循环的结果 ② DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 ①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且