铁离子对迟缓爱德华氏菌生物膜形成适和基质组成的影响-湖南.docVIP

－PAGE 20－ －PAGE 1－ 湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划 项　 目　 申　 报　 表 项目名称: 铁离子对迟缓爱德华氏菌生物膜形成和基质组成的影响 学校名称 湖南农业大学 学生姓名 学 号 专 业 性 别 入 学 年 份 钟为铭 201440566114 水族科学 男 2014级 钟浪 201440566118 水族科学 男 2014级 叶涛 201440566113 水族科学 男 2014级 王雅琳 201440566111 水族科学 男 2014级 陈康勇 201440566135 水族科学 男 2014级 指导教师 高志鹏 职称 讲师 项目所属 一级学科 水产学 学生曾经参与科研的情况 参与学生均无参与科研的经历。 指导教师承担科研课题情况 1、国家自然基金面上项目，鲶爱德华氏菌Ⅲ型与Ⅵ型分泌系统致病的分子机制研究，2010-2012，参与。 2、国家自然基金面上项目，鲶爱德华氏菌多拷贝质粒pEI1和 pEI2编码的毒力蛋白的分子致病机理研究，2012-2015，参与。 项目研究和实验的目的、内容和要解决的主要问题 一、目的和意义 迟缓爱德华氏菌作为重要的鱼类病原菌，其致病性与生物膜形成密切相关，而Fe3+又与细菌生物膜的形成、结构和基质组成密切相关。因此，本研究拟通过结晶紫染色、CLSM、SEM和FilmTracer? LIVE/DEAD? kit染色等方法，研究Fe3+在迟缓爱德华氏菌生物膜形成、结构和生物膜内细菌生存能力等方面的作用；通过利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）技术和SYPRO? Ruby染色、FITC-ConA染色和DDAO染色等方法分别研究Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜基质中蛋白质、多糖和胞外DNA的分布和形成的影响。最终阐明Fe3+在迟缓爱德华氏菌生物膜形成中的作用机理，迟缓爱德华氏菌与耶尔森氏菌和沙门氏菌等人类病原菌同属于肠杆菌科，研究Fe3+在迟缓爱德华氏菌生物膜形成中的作用机理，可为人类主要肠道病原菌的相关研究提供重要的理论依据。同时，也为阻止和破坏生物膜形成而造成的药物抗性提供理论依据。 二、项目研究内容及实施方案 1、Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜形成的影响 （1）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生长的影响 利用分光光度计测定迟缓爱德华氏菌在以下三种培养条件下、在不同生长时间（0-36 h）菌液的吸光度值（波长540），即OD540的值，并绘制出相应的生长曲线，比较迟缓爱德华氏菌在三种不同培养条件下生长情况的差异。三种培养条件分别为：①只加培养基（DMEM）；②培养基（DMEM）+FeCl3；③培养基（DMEM）+ FeCl3+乙二胺四乙酸（EDTA，铁离子螯合剂） （2）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜形成过程的影响 利用结晶紫染色法（Crystal violet stain）和激光共聚焦成像法（CLSM）比较迟缓爱德华氏菌在上述三种培养条件下、在4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、和24 h时生物膜的形成能力和发展情况。 （3）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜结构的影响 利用扫描电镜（SEM）和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察在上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜结构的变化和差异，并利用Zen和COMSTAT等软件分析生物膜的细菌密度（Cell density）、粗糙度（Roughness）、厚度（Thickness）等结构指标。 （4）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中细菌生存能力的影响 利用FilmTracer? LIVE/DEAD? kit染色方法和激光共聚焦（CLSM）成像技术比较上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜内细菌的生存能力。在染色过程中，SYTO? 9染料（绿色）可以标记生物膜中所有细菌（包括完整细胞膜-活菌、不完整细胞膜-死菌）的细胞核，而propidium iodide（PI、红色）染料只能标记细胞膜损伤（即死菌）的细胞核。因此在整个生物膜中，活菌被标记成绿色，而死菌被标记成红色。 2、Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜基质组成的影响 （1）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中蛋白质组成的影响 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）技术和SYPRO? Ruby染色方法比较上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜中蛋白质组成的差异。 （2）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中胞外多糖（EPS）组成的影响 利用FITC-ConA染色方法和激光共聚焦（CLSM）成像技术比较上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜中胞外多糖的定位和组成差异。 （3）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中胞外DNA（eDNA）组成的影响 利用DDAO [7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin)]染色方法和激光共聚焦（CLSM）成像技术比较