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基因工程步骤 基因操作的基本步骤 基 因 工 程 的 基 本 过 程 基因操作的基本步骤 1）获得目的基因（目的基因的获取 ） 2）制备重组DNA分子（基因表达载体的构建 ） 3）转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞） 4）筛选重组细胞 5）实现功能表达 目的基因的检测和表达 目前被较广泛提取使用的目的基因有： 苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。 供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪去多余部分 目的基因 限制酶 (一）获得目的基因 目的基因的提取方法 直接分离基因 人工合成基因 反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA ：鸟枪法 1）鸟枪法： 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 与载体连接 载入 受体细胞 产生特定性状 导入 外源DNA扩增 目的基因 分离 (散弹射击法、直接分离法) 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 目的基因的mRNA 单链DNA(cDNA) 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 2）反转录法： 3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点 缺点 鸟枪法 反转录法 根据已知氨基酸合成DNA法 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1）DNA序列自动测序仪： 2）PCR技术： 对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。 PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大 染色体 PCR 基因放大连琐反应 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 2）聚合酶链式反应即PCR技术 （二）基因表达载体的构建 基因表达载体的组成： 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。 a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 e、复制原点 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 结构基 因 RNA聚合酶 半乳糖苷酶 酶 酶 RNA聚合酶 启动子 RNA聚合酶 终止子：位于基因的尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的 转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞 中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 目的基因 载体 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 基因组 （三）目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 转化 —— 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——感受态细胞 1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法 （1）农杆菌介绍 （2）原理及适用范围 2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法：显微注射法 （2）程序： 2.微生物作受体细胞原因： 将目的基因导入微生物细胞 3.转化方法： 大肠杆菌 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 处理细胞→ 细胞→表达载体与感受态细胞混合→ _________细胞吸收DNA分子。 Ca2+ 感受态 感受态 1.常用菌： （四）目的基因的检测和表达 四环素 抗性基因 氨苄青霉 素抗性基因 初选