细胞培养方法.pptVIP

（五）、胰 将胰脏标本修剪切碎后消化，并使之浮于牛血清白蛋白溶液之上，经过3次离心分离，收集细胞，在水浴槽中用旋转法使细胞聚集，接种于涂布了胶原的培养皿，可获得体外培养的胰腺细胞。 用品： （1）摇动式培养箱 （2）锥形瓶，容积25ml，经硅化处理 （3）尼龙筛，孔径25μm和40μm；透析袋、5ml或10ml吸管、胶原涂布的培养皿 （4）HBSS、无Ca2+、Mg2+、HBSS (HBSS—DVC) （5）F12组织培养液，加20%小牛血清 （6）I型胶原酶： （7）0.25%胰蛋白酶，溶于柠檬酸盐缓冲液，每升含柠檬酸三钠3g，NaCL 6g，葡萄糖5g，用NaOH调pH至7.6 （8）牛血清白蛋白（BSA） 结果： 其中30~40%可判断为腺细胞，在光学和相差显微镜下都可观察到酶原小滴。 如果用已照射过的肺纤维细胞作为滋养层，细胞的3H—TdR掺入及存活期均可明显增加。 （六）、肾 从基质中可以分离出肾小管细胞，因为这些细胞含有D—氨基酸氧化酶，能够在D—缬氨酸中生长，基质细胞则不可，用胶原酶消化切碎的肾脏组织10h左右，再用吸管吹打则可获得肾小管及肾小球上皮细胞。 （七）、气管及支气管上皮 有血清存在。气管上皮细胞停止分裂，不会终分化。在无血清培养液中接种气管组织碎块，可以促进气管细胞生长，并抑制成纤维细胞生长。 二、中胚层细胞的培养 （一）、结缔组织细胞 　　 在细胞培养中结缔组织细胞最容易生长，不需要特殊条件。统称为成纤维细胞。成纤维细胞系中3T3系，成纤维细胞可分泌I和Ⅲ型胶原，大量分泌I型胶原则是结缔组织细胞的特点。结缔组织细胞可向多个方向分化。可采用组织块法培养。 （二）、脂肪组织细胞 　　脂肪组织细胞中很难培养出脂肪细胞。成纤维细胞可被诱导分化出脂肪细胞，血清中的脂肪形成因子可能具有诱导作用。 （三）、肌肉组织细胞 　　骨骼肌、心肌、平滑肌细胞均可在体外培养中生长，心肌细胞在培养中还具有自动节律性收缩功能，传代培养后可能逐渐丧失这种功能。平滑肌细胞可通过胰蛋白酶或胶原酶消化法从血管壁、气管壁及肠壁等获得. （四）、软骨细胞 　　软骨分为生长部和休止部，休止部软骨细胞表现为终末分化细胞的特性，无形成软骨基质的能力。生长部软骨细胞在体外培养条件下代谢较活跃，具有形成软骨基质的功能和成骨细胞的某些特性。 软骨细胞易于在弱碱性，增加Mg2+浓度的培养液中生长。由于软骨细胞包于糖蛋白基质中，必需消化方可获得软骨细胞。用透明质酸酶、胰蛋白酶和胶原酶联合消化。 用品： （1）Gey’s平衡盐溶液（GBSS），pH7.0，为防止污染可加入抗菌素，如100U/ml青霉素，100μg/ml制霉菌素 （2）F12培养液加12%胎牛血清，2.3m mol/L Mg2+，100U/ml链霉素，pH7.6无血清F12培养液 （3）0.5%睾丸透明质酸酶，溶于GBSS，加入青霉素100U/ml，链霉素100U/ml （4）0.2%胶原酶，溶于GBSS （5）0.2%胰蛋白酶，溶于GBSS （6）0.25%胰蛋白酶，溶于无Ca2+、Mg2+生理盐水 关节软骨细胞分离培养：将生后当天乳兔12只，分3次，在无菌条件下解剖分离乳兔的双侧下颌骨髁状突，仔细剥离髁状突软骨表面的纤维被膜，然后切取半透明状的髁状突软骨，用锐利小剪刀将其剪碎成1mm3 大小，放于离心管中，先用0.25%胰蛋白酶37℃消化30min，离心5 min（1000rpm），弃上清后加入0.1%胶原酶IA 3ml，37℃下消化5h后，用吸管将沉于底部的组织及细胞轻轻悬浮后，用200μm滤网滤过后离心沉淀细胞，再用含10%FBS DMEM培养液（含青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml）将细胞悬浮后，接种于培养瓶在5%CO2 、95%空气、饱和湿度、37℃孵浴箱内进行培养。 软骨细胞鉴定： 形态观察：多角形，类似上皮样细胞，可形成具有折光性的细胞外基质，甲苯胺兰染色呈异染性。 细胞组织化学染色：软骨细胞可特异性的合成葡萄糖胺聚糖（GAG）、分泌Ⅱ型和Ⅹ型胶原，并具有碱性磷酸酶活性，抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。 （五）、骨细胞 　　骨细胞是终末分化的细胞，埋藏于骨基质之中。尚未见到从皮质骨中分离培养出纯骨细胞的报导，只是在进行成骨细胞培养时可见到少量星状细胞，可形成花边样网状结构。在某些激素（如甲状旁腺素）的作用下，或去除培养液中血清的条件下，这些细胞可变为圆形，二羟基维生素D3可以刺激某些成骨样细胞变星状。已制备出抗骨细胞的特异性单克隆抗体。 （六）、成骨细胞 在骨组织、骨膜中均有成骨细胞。可用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法以及骨髓培养法分离培养出成骨细胞。 １．骨组织