免疫胶体金银技术.pptVIP

（一）胶体铁的制备 通过FeCl3的煮沸完成 1946年--FeCl3直接煮沸法 1951年--FeCl3溶于甘氨酸和氨水的混合液中 1983年--FeCl3倒入煮沸的二甲砷酸钠溶液或FeCl3与二甲砷酸钠溶液一起煮沸 1986年--水合联胺-二甲砷酸- FeCl3煮沸法 也可用二甲砷酸代替二甲砷酸钠 具体步骤： 二甲砷酸钠溶液+浓盐酸+水合联胺+FeCl3 将混合物加热煮沸至变成深棕色的胶体砷酸铁，室温冷却 再以二倍体积的二甲砷酸钠缓冲液稀释即可标记 该法制备的铁胶体呈深棕红色，颗粒1nm左右，pH4-8稳定，4℃贮存备用。 （二）抗体的标记和纯化 胶体铁在pH7.4时通过离子键与抗体IgG（PI6.8-7.3）结合而不影响抗体活性； 胶体铁的等电点为7.8-7.9，标记时用0.1mol/L碳酸钾将胶体的pH调至7.4（每毫升胶体0.2-1mg蛋白量） 纯化标记抗体---层析柱 CM-Sephadex C-50 Amberlight CG-50 抗体鉴定：免疫斑点法和免疫细胞化学染色法 制备的胶体铁深棕红色，颗粒小，稳定性高，其pH接近中性，标记效果好 （三）免疫胶体铁细胞化学染色 （1）染色步骤 1) 石蜡切片常规脱蜡至水，PBS漂洗。 2) 用10％牛血清白蛋白封闭，37℃20min。 3) 滴加特异性抗体(一抗)，4℃过夜，PBS漂洗。 4) 滴加胶体铁标记的第二抗体，37℃30min。 5) 蒸馏水漂洗3次。 6) 1％亚铁氰化钾与1％盐酸混合液显色约20min。 7) 自来水洗，必要时用核固红复染胞核。 8) 常规脱水、透明、中性树胶封同。 （2）结果：阳性颗粒为蓝色，细胞核为红色。 （四）优点及应用 优点 胶体铁与抗体结合呈电中性，很少再与组织发生吸附，并不受内源性酶活性的干扰； 普鲁士蓝反应只显示标记的三价铁，不显示组织中内源性二价铁 免疫胶体铁间接法敏感性与IGSS相同，但高于ABC法，优于免疫酶及免疫金银染色。 应用 结合免疫酶及IGSS法进行光镜下抗原的双标及多标记： 胶体铁的呈色产物为蓝色的亚铁氰化铁，稳定，且与棕色的DAB产物及黑色的银颗粒颜色对比明显。 免疫电镜： 胶体铁标记抗体直径比胶体金及铁蛋白标记抗体小，穿透力强，可用于抗原的超微结构定位 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * 第六章 免疫金银及铁标记技术 免疫金技术发展简史 1971年 胶体金应用于免疫组化 1978年免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原 1981年免疫金银法 1986年彩色免疫金银法 免疫胶体金银技术 一、免疫金技术 二、免疫金银法 三、彩色免疫金银法 四、免疫金和免疫金银法的优点 五、免疫金银法染色中常见的问题及对策 六、免疫胶体铁技术 一、免疫金技术 胶体金：金的水溶液，具有一般溶胶特性。 胶体金制备：化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子变成金原子（氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。 胶体金颜色：用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。 5-20nm 葡萄酒红 20-40nm 深红色 60nm 橙黄色 还原剂：白磷、乙醇、过氧化氢、枸橼酸钠、鞣酸等 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合。此外，还可与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合。 (2)试剂 容器: 酸处理洗净 配制试剂: 双蒸馏水或三蒸馏水 氯化金水溶液的配制：1g的氯化金溶解于双蒸水中配成l％的水溶液；4℃冰箱内保存。 白磷配制：在双蒸水中切块，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密闭保存 不需硅化处理可直接制备胶体金。 为了减少了金颗粒的吸附作用，也可用已制备的同等大小颗粒的胶体金溶液包被玻璃器皿表面，弃去，再用双蒸水洗净。 流水冲洗；清洁液浸泡24h；自来水洗