专题2-课题二-土壤中分解尿素的细菌的分离和计数.docVIP

第 第 PAGE 1 页 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 一、课题背景 1、尿素的利用：p21上//为止。 2、细菌能利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2)2+H2O 脲酶 CO2+2NH3 常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌，小球菌，加单胞杆菌，克氏杆菌，棒状杆菌，梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。 4、课题目的： 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。 二、研究思路：筛选菌株——统计菌落数——设置对照 （一）筛选菌株 1、实例一：PCR技术。P21第一段//为止。 原因：热泉温度70-80°C，淘汰了绝大多数微生物，只有Taq细菌被筛选出来。 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求到相应的环境中去寻找。 2、实验室中微生物的筛选原理：P21下-p20上 要分离一种微生物，必须根据微生物的特点，包括营养，生理，生长条件等。 方法：抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法，对它进行纯化培养分离。 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：p22上 （1）从物理性质看此培养基属于：固体培养基 （2）在此培养基中：碳源——葡萄糖。氮源——尿素 4、培养基选择分解尿素的微生物原理 培养基的氮源为尿素，只能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖而受到抑制，所以用此培养基就能够选择分解尿素的微生物。 分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。 5、选择培养基：P22上 6、怎样证明此培养基具有选择性 培养基类型 是否接种 目的 结果 实验组 以尿素为唯一氮源的培养基 是 分解尿素的细菌 只生长尿素细菌 对照组 牛肉膏蛋白胨培养基 是 判断该培养基有无选择性 生长多种微生物 （二）统计菌落数 1、间接计数法： （1）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上，所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先一个细胞。 （2）统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。P22 ①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。 P22小字部分：两位同学说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少三个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新做实验。 ②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数。P22左下 注意：①：为保证：P22①。 ②：为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或者三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 ③统计菌落数往往比活菌的实际数目低。 ④利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。 （三）设置对照 注意目的：P22下 判断培养基是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养 判断培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目 实例：P22-P23小字。 原因：土壤不同 培养基污染或者操作失误或者混入了其他的含氮物质 对照实验：P23右上 2、显微镜直接计数法计数：血细胞计数板法 ①结构：常用的是1 mm×1 mm×0.1 mm方格的计数板(如图)。每个计数板上有两个计数室，每个计数室上刻有9个大方格，其中只有中间的大方格为计数室，大方格的长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其容积为0.1 mm3；大方格内分为25个中方格，每一中方格又分为16个小方格，即大方格是由400个小方格组成的。 ②操作：在清洁干燥的血细胞计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的菌液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，充满计数室。 ③计数：在显微镜下计数4～5个中方格内的菌体数，求出每个小方格所含有的细菌的平均数，按照以下公式计算：每毫升原液含有的菌数＝每小方格平均细菌数×400×104×原液被稀释倍数。 ④缺点：不能区分死菌与活菌；不适于运动细菌的计数；需要相对高的菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。 实验设计：P23 实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。 、土壤取样P23下，注意划线部分。 取土样时用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌 制备培养基 P24中：由于初次实验，对于稀释度的范围没得把握，因此选择了一个比较宽的范围：稀释倍数103~10