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HPAC 亲和柱的制备——交联配体到介质上 分两步：第一步活化介质 第二步将配体交联到介质上。 HPAC配基 ?合成基团 —亲和配基 金属离子（Zn、Ni） 染料（三嗪类染料）—专一性差、价廉、稳定性好。 HPAC配基 ?天然基团配基——化学稳定性差 核苷酸配基（ATP） 氨基酸配基（组氨碱） 植物凝集素—能可逆性结合碳水化合物的蛋白质，由于凝集素洗脱条件温合，易于操作，现应用日渐广泛，有较好的产业化趋势。 凝集素 ?至少每个分子有两个碳水化合物结合部位，可以用作糖蛋白的亲和配基。 ?每毫升年度可偶联1~100mg凝集素， ?这种活化的介质（溴化氢等）既有商品购买，也可自行活化，可降低成本50~60倍； ?上样时减慢速度有助于凝集素—糖蛋白结合； ?增加柱温到37℃ 有助于结合，降低柱温有助于洗脱。 凝集素 ?上样前用高盐洗柱可减少非特异性结合； ?硼酸盐缓冲液有助于困难的洗脱。因为它能结合某些糖蛋白； ?在整个过程中应避免使用磷酸盐缓冲液。因为它易于二价离子产生沉淀。 HPAC配基 ?由于配基的脱落，对蛋白质的纯度有较大影响，增加了纯化步骤； 这种介质的使用寿命只能使用2~3次（尽管说明书说明可使用5~10次）； 目前在科研上采用的竞争性洗脱，尽管洗脱条件温和，但又一次增加了纯化步骤及成本； 目前HPAC用于产品化报道的文献极少，而用于科研的报道极多。 配基活化化合物及介质 配基结合基团 偶联试剂 适合的介质 供应商 氨基 溴化氰 琼脂糖 pharmacia 聚丙烯 氨基 戊二醛 聚丙烯酰胺-琼脂糖 IBF Sepracor 氨基 羟基琥珀酰胺 交联琼脂糖 pharmacia 氨基或硫基 甲苯磺酰基或tresyl氯化物 琼脂糖 Pierce Sigma 氨基或羧基 碳二亚胺 琼脂糖 Bio-Rad pharmacia 交联琼脂糖 Pierce 碳水化合物 酰肼 交联琼脂糖 Bio-Rad Pierce 聚苯乙烯 Sigma 目前广州蓝星公司生物治疗药物产业化开发 CEA T细胞表位改构疫苗在原核与真核表达体系的表达 高效低毒突变型TNF-α在原核系统的表达 类风湿性关节炎融合蛋白在真核系统的表达 广州蓝星生物科技开发限公司 ? 电话：020网址： 电邮：laxiwh@263.net 肿瘤治疗性疫苗 ●上市产品：黑色素疫苗（Corixa公司，加拿大）。 ●临床Ⅲ期：IMC—BEC2（Imclone公司），用于肺癌。 ●临床Ⅰ期：HER/Neu基因蛋白疫苗（ Corixa公司）， 用于乳腺癌（2003年6月）； 质粒DNA疫苗（ Corixa公司），用于肺癌。 目前肿瘤治疗性疫苗还有诸多问题有待于解决，主要表现在以下几个方面： 第一，众多实体肿瘤缺乏特异性抗原，尽管目前已在实体肿瘤中发现了500多种肿瘤抗原，但只有少数抗原较为特异，且这些抗原免疫原性较弱。在近几年的研究中发现：仅激活CD8+ T细胞不足以产生有效的细胞免疫，同时需要CD4+ T细胞参与。而目前的疫苗缺乏这种设计。 第二、疫苗缺乏有效的抗原递呈。现有的疫苗在此环节上存在两个严重问题：一是进入的大部分疫苗与APC不能充分接触难以实现抗原递呈；二是即使有少量疫苗被APC捕获，也因抗原表达量甚微难以发挥有效的抗原递呈。 第三、如何打破机体免疫耐受。肿瘤细胞通过下调Fas的表达来逃避Fas介导的细胞凋亡。尽管目前通过采用共刺激分子修饰的疫苗有可能打破机体对肿瘤的免疫耐受，但目前尚缺乏有效的实