分子生物学研究技术应用介绍.ppt

(1)PCR常用于合成特异探针通常PCR所加两端引物的摩尔数是相等的，若加入不等量的引物，例如60:1，即为不对称PCR(asymmetric PCR)，可用于合成单链探针或其他用途的单链模板。 (2)用于DNA的测序PCR可用于制备测序用样品。 (3)RT-PCR将反转录技术与PCR技术相偶联，可用于扩增被反转录成cDNA形式的特定RNA序列。RT-PCR主要用于： ①分析基因转录产物， ②构建cDNA库， ③克隆特异cDNA， ④合成eDNA探针， ⑤构建RNA高效转录系统等。 (4)产生和分析基因突变PCR技术十分容易用于基因定位诱变。利用寡核苷酸引物可在扩增DNA片段的末端引入附加序列，或造成碱基的取代，缺失和插入。 (5)重组PCR将DNA不同序列连在一起。重组PCR在基因工程操作中十分有用，用酶切割和连接常常找不到合适的酶切位点，而且引入的多余序列无法删除。重组PCR只需设计3个引物：①左边DNA片段的5′引物；②连接两片段的引物；③右边片段的3′引物，经过数轮PCR即可将两片段连在一起。 (6)未知序列的PCR扩增通常PCR必须知道欲扩增DNA片段两端的序列，才能设计一对引物用以扩增该片段。但在许多情况下需要扩增的片段序列是未知的，一些特殊的PCR技术可用来扩增未知序列，或从已知序列扩增出其上游或下游未知序列。反向PCR(inversfi PCR)通过使部分序列已知的限制片段自身环化连接，然后在已知序列部位设计一对反向的引物，经PCR而使未知序列得到扩增(图13-15A)。 从染色体已知序列出发，通过重复进行反向PCR，逐步扩增出未知序列的技术，称为染色体步移(chromosome walking)，为染色体DNA的研究提供了有用的手段。 (图13-15B)。 此外还有一些PCR技术可以扩增未知序列。例如，锚定PCR(anchoredPCR)，用末端核苷酸转移酶在合成DNA链的3′端加上均聚物，再用此均聚物互补的寡聚核苷酸作为另一引物进行PCR。利用人类基因组DNA中分散分布的Alu序列，用一段已知序列和Alu序列作为一对引物，也可以扩增出未知序列. (7)基因组序列的比较研究应用随机引物的PCR扩增，便能测定两个生物基因组之间的差异。这技术称为随机扩增多态DNA分析(random amplified polymorphic DNA,，RAPD)。如果用随机引物寻找生物细胞表达基因的差异，则称为mR_NA的差异显示(dfifferential display)。PCR技术在人类学、古生物学、进化论等的研究中也起了重要的作用。 (8)在临床医学和法医学中的应用PCR技术已被广泛用于临床诊断。如对癌基因、遗传病等疑难病和恶性疾病的确诊，病原体的检测(某些恶性疾病用一般微生物学、生化和免疫学技术无法查出时)，确定亲属间的亲缘关系，胎儿的早期检查等。 13.8 DNA的化学合成 1956年，Khorana首次成功合成了二核苷酸。将核苷酸所有活性基团都用保护剂封闭，只留下需要反应的基团，用活化剂使反应基团激活，再用缩合剂使一个核苷酸的羟基与另一核苷酸磷酸基之间形成磷酸二酯键，定向聚合，这种DNA合成法称为磷酸二酯法。 DNA自动化合成采用快速的亚磷酸三酯法。腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基保护，鸟嘌呤碱基的氨基用异丁酰基保护，5′-羟基用二甲氧三苯甲基(DMT)保护。 13.9 基因定位诱变 基因定位诱变是指按照设计的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换和重组等变异。目前常用的定位诱变方法主要有：在酶切位点处插入、删除和置换序列。采用寡核核苷酸指导的诱变(oligo nucleotide-directed mutagenesis)和PCR诱变手段。 13.9.1 酶切诱变 利用基因的酶切位点，可在其切点处改造基因序列。先选择合适的限制酶将基因切开，然后插入或删除有关序列。如若基因内部在需要诱变的部位缺乏可被利用的限制酶酶切位点，就要先用寡核苷酸指导的诱变或PCR诱变引入酶切位点。有时不能确定插入或删除的最适序列，可以插入一组变异的序列或是进行系统的插入或删除，由此构建成突变体库，从中再挑选最理想的突变体。 13.9.2 寡核苷酸指导的诱变 Hutchison等用合成的寡核苷酸在体外诱导单链噬菌体~PXl74发生变异。用带有错配碱基的寡核苷酸与φX174的单链DNA退火，并以其作为引物用Klenow酶合成DNA，所产生局部异源双链的DNA转染细菌，结果使显示预期表型噬菌体的频率有明显增加。后来Smith改进此法，用噬菌体M13载体克隆基因作定位诱变，使定位诱变技术趋于成热并得到广泛应用。寡核苷酸指导的定位诱变包括