分子生物学研究法修定年.pptVIP

* 膨胀成球形，细胞膜通透性发生变化极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成复合物； * TA连接：扩增目的片段时，72°10min会在3‘端加一个A，正好与T载体上的T结合。 * 蓝白斑筛选的原理 :现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的N端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 * SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以