3种甜樱桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR检测方法的建立与应用.docxVIP

中国农业科学 2014,47(6):1111-1118 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.007 3 种甜樱桃病毒 PNRSV、PDV 及 LChV-2 的多重 RT-PCR 检测方法的建立与应用 宗晓娟，王文文，魏海蓉，王甲威，陈 新，徐 丽，刘庆忠 （山东省果树研究所/山东省果树生物技术育种重点实验室，山东泰安 271000） 摘要：【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）、李矮缩病 毒（Prune dwarf virus，PDV）、樱桃小果病毒 2（Little cherry virus-2，LChV-2）的多重 RT-PCR 检测方法。 【方法】以复合感染 3 种病毒的甜樱桃病株叶片为材料，采用 CTAB 法提取样本总 RNA，选用随机六聚体引物对植 物样本总 RNA 进行反转录，所得 cDNA 作为多重 RT-PCR 的扩增模板。根据 GenBank 中 PNRSV、PDV、LChV-2 基因组 序列共设计 6 对特异引物，分别通过单一 RT-PCR 和多重 RT-PCR 筛选出可用于同时检测 3 种甜樱桃病毒的引物组 合。对多重 RT-PCR 的退火温度及循环数进行优化，以筛选出各引物组合的最适扩增条件。分别以单一感染 PNRSV、 PDV、LChV-2、复合感染 3 种病毒、单一感染樱桃病毒 A（Cherry virus A，CVA）及甜樱桃无毒苗为样本，对 多重 RT-PCR 引物的特异性进行分析。选取复合感染 3 种病毒的甜樱桃总 RNA 的反转录产物为初始模板，按照梯 度稀释法依次将模板稀释为 2、22、23、24、25 倍，在相同 PCR 反应体系及反应条件下分别对各引物组合的灵敏 度进行分析。多重 RT-PCR 的扩增条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至 pMD18-T vector，克隆测序，以验 证多重 RT-PCR 检测的准确性。并应用该方法对山东泰安地区甜樱桃生产园中间隔栽培的中国樱桃进行检测。【结 果】筛选到 2 个可以应用的引物组合，组合 1“PNRSV-S1/A1、PDV-S2/A2、LChV2-S1/A1”可分别特异性地扩 增 733、467、337 bp 的片段。组合 2“PNRSV-S1/A1、PDV-S3/A3、LChV2-S1/A1”可分别扩增得到 733、265、 337 bp 的片段。扩增产物大小与预期相符。多重 RT-PCR 反应条件优化结果显示，在退火温度 52℃、35 个循环 条件下，2 个引物组合的检测效果均较为理想。特异性分析结果显示，2 个引物组合均能特异性检测其各自的靶 病毒。灵敏度分析结果显示，2 个引物组合在 cDNA 的 23×稀释液中仍能特异性扩增，但扩增条带的强度稍有差 异，其对植物总 RNA 的反转录产物的最低检测浓度为 107.9 ng·μL-1。克隆测序及序列分析表明，2 个引物组合 对各自靶病毒的检测结果可靠。应用该方法对 9 个中国樱桃样本进行检测，结果显示，测试样品均至少感染了 2 种病毒，其中 5 个样品复合感染了 3 种病毒，2 个样品同时感染 PDV 和 LChV-2，2 个样品同时感染 PNRSV 和 LChV-2。【结论】应用建立的多重 RT-PCR 检测方法可稳定、准确、灵敏的同时检测单一或复合侵染的 3 种甜樱 桃病毒。 关键词：李属坏死环斑病毒；李矮缩病毒；樱桃小果病毒-2；多重 RT-PCR；病原检测 Development and Application of a Multiplex RT-PCR Assay for Detecting Three Sweet Cherry Virus Species ZONG Xiao-juan, WANG Wen-wen, WEI Hai-rong, WANG Jia-wei, CHEN Xin, XU Li, LIU Qing-zhong (Shandong Institute of Pomology/Key Laboratory for Fruit Biotechnology Breeding of Shandong Province, Taian 271000, Shandong) Abstract: 【Objective】The objective of this study is to develop a multiplex RT-PCR protocol to detect 3 sweet cherry virus 收稿日期：2013-09-13；接受日期：2013-10-28 基金项目：农业部公益性