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《本科实验教学》 基因工程实验指导 贵州大学农业生物工程研究院 2015年4月 实验一DNA片断的连接、转化及酶切鉴定 一、实验原理： 实验所用载体为Promega公司T载体pGEM?-T Easy Vector，特点为在载体中存在两个T末端。 使用LA Taq进行扩增得到的大部分PCR产物3’端附有一个“A”碱基。 T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3，5磷酸二酯键。PCR胶回收产物游离A末端与载体的T末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。 转化指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA分子导入受体细胞体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌转化常用化学法（CaCl2法），其原理是培养至对数生长期的细菌在0℃经过低渗CaCl2溶液致敏处理，就可以成为高效的感受态细胞，这种感受态细胞与质粒混匀置于0℃30min，混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，再经42℃短时热激处理，促使质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。 蓝白斑筛选是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补，抗生素基因等（本实验中使用的T载体pGEM?-T Easy Vector本身具有Amp抗性）。现在使用的许多载体都有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，β-半乳糖苷酶基因在缺失近操纵区段的宿主细胞与带有完整近操纵区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由于α-互补而产生的β-半乳糖苷酶基因和细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时，可产色蓝色菌落，易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，宿主细胞与质粒之间不能形成α-互补，从而使带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体。用含有一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，采用碱性SDS（十二烷基硫酸钠）溶液裂解菌体的细胞壁，使质粒缓慢释放出来，同时整个液体的pH为12-12.5，双链DNA变成单链，当pH调至中性并有高盐浓度存在下，绝大多数变形质粒恢复自然状态溶在液体中，而变形染色体不能复性，断裂呈线性的单链细菌染色体DNA 相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质形成沉淀，离心获得含有大量质粒的上清液，再利用适当浓度的亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇）使质粒DNA脱水，离心等到质粒沉淀。 限制性内切酶能识别并切割特异位点的DNA序列。其被广泛应用于载体构建。提取的质粒DNA，利用限制性内切酶EcoR I（GAATTC）进行酶切，可将目的基因切下。酶切结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。 二、实验材料 PCR胶回收产物，pGEM?-T Easy Vector（Promega），已制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞 三、实验仪器 PCR仪、制冰机、水浴锅、37℃摇床、离心机、涡旋振荡器、电泳槽 四、实验试剂 SolutionⅠ（0-4℃保存）:50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl(pH8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0) SolutionⅡ(现配现用):0.2mol/LNaOH；1% SDS SolutionⅢ（0-4℃保存）:0.2mol/L KAC 60mL；冰乙酸 11.5ml；ddH2O 28.5ml(pH4.8) Rnase: 100mg Rnase粉剂，溶于10ml 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl缓冲液中，水浴煮沸15min,冷却，－20℃保存。 五、实验步骤 1.PCR产物的连接 于冰水浴中配制如下反应体系。 总体积 10.0μL T4 DNA 10×lig Buffer 1.0μL pGEM?-T Easy Vector 1.0μL PCR产物 3.0μL T4 DNA连接酶 1.0μL ddH2O 4.0μL 用移液枪吹打连接反应使之混匀后，4℃孵育过夜。 2.连接产物转化大肠杆菌 （1）将-80℃保存的DH5α感受态细胞置于冰中溶解10min。 （2）取100μL感受态细胞至新的1.5mL离心管中。 （3）向感受态细胞中加入0.1ng-10ng（约7ul）转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30min。 （3）42℃水浴锅中放置45s后，立即冰中放置2min。 （4）加入890μL 37℃预温的LB