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质粒DNA的提取及定性定量分析 实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法 实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间，拓扑学上的差异而达到分离目的。在PH介于12.0~12,5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，而共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密结合在一起，当加入PH4.8的乙酸甲高盐缓冲液恢复PH至中性时，共价闭合的环状质粒DNA的复性迅速而准确，而线性染色体的DNA因两条互补链已完全分开，复性就没这么迅速准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与大分子的RNA、蛋白质—SDS复合物等一起，沉淀下来而被除去。 实验器材及用品：小指管、台式离心机、漩涡振荡器、大肠杆菌，冰、溶液I、溶液II、溶液III.、酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液 等 实验内容： 1、将过夜培养的大肠杆菌菌液加入1.5ml小指管中，4000r／min 1min， 吸去培养液，将所有菌体细胞收集到一个小指管中。 2、加入100微升溶液I于含菌体细胞的小指管中，漩涡震荡将细胞沉淀悬浮， 室温放置10min. 3、加入200微升溶液II（新鲜配制），轻轻混匀内容物，1min之内加入150 微升溶液III（冰上预冷），盖紧管口，轻轻混匀数次，冰上放置15min让质粒DNA复性（千万不可以用漩涡振荡器）。 4、12000r／min离心10min，将上清液转至令一1.5ml小指管中。 5、向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1去蛋白质和脂质），漩涡 混匀后，冰上放置10min，12000r／min离心10min，将上清液转至令一1.5ml小指管中。 6、向上清液加入2倍体积无水乙醇，漩涡混匀后，冰上放置10min，12000r ／min离心10min，吸去上清液。 7、用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀一次，12000r／min离心5min，吸去 上清液，空气中干燥。 8、加入20微升TE缓冲液，使质粒DNA完全溶解，--20℃保存。 定性定量分析： 实验步骤 实验原理 1 将含pETBlue－2的单菌落接入3mL LBAmp 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 让菌苏醒，增加菌的数量。 2 培养的菌液，6000rpm，离心2min。 去上清收集沉淀。 收集、浓缩菌体。 3 100 uL溶液I充分重悬菌体 这一步仅仅是为了吹散细胞。 4 200uL溶液II，反复颠倒混匀（切勿旋涡振荡！）， 冰上放置，裂解至菌液变清。 利用碱法破碎细胞和提取质粒。 碱法破碎细胞是因为NaOH可以破坏细胞膜糖苷键，SDS可以破坏膜、变性膜蛋白。 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，基因组染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 这一步之后，细胞破碎，液体中将不会有沉淀而澄清。 因为细胞破碎，核基因组也释放到液体中，如果强烈震荡，会使核基因组因机械剪切断裂为小片断，在以后的离心中，不能与质粒分开，从而污染质粒。所以，要轻摇。 5 加入150uL溶液III，反复颠倒混匀，冰浴5分钟。 高盐（K+）。 这就是DNA复性。基因组染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 6 12000rpm，离心10min。小心取出上清 这时上清中有质粒、还有杂质的蛋白、脂类、糖类、可溶的小分子。 7 向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24:1)， 剧烈振荡混匀，12000 rpm，离心10 min，将上清 转移到另一离心管中 异戊醇防止液体在振摇时起泡；酚可以变性蛋白质并使其沉降；氯仿可以提取脂类，液体分层。 这里得酚是tris饱和酚，这样的酚饱和了水，不会抽提水层中的水，以致将DNA一并抽到有机层。Tris还可以起到调节PH稍微偏碱的作用。 这时蛋白质沉淀于两层之间（密度的原因）。 标记离心方向，因为沉淀有时看不见，而我们吸取液体是要从沉淀的反方向。 8 上清中加入等体积氯仿：异戊醇(24:1) ，剧烈振 荡混匀，12000rpm，离心10 min，将上清转移到 另一离心管中。 去除酚，因为酚会影响双酶切酶的活性 9 上清中加入2倍体积无水乙醇剧烈振荡混匀， 室温放置15 min沉淀DNA。12000rpm，离心 10 min，弃上清。 脱水，因为液体中含有大量的盐（溶液III），使DNA和RNA沉淀下来。而液体中委要出去的小分子、剩余的糖和脂。 10 沉淀用1mL75%乙醇洗两次(12000rpm， 离心5 min)。 11 沉淀充分干燥。用2