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VEGF165低氧启动重组腺相关病毒的构建及表达1 李桂林、栗世方、窦万臣、张波、王欣*、孔燕国、王任直 中国医学科学院，中国协和医科大学，北京协和医院 100730 摘 要：目的 构建VEGF165低氧启动rAAV用于缺血性脑血管病的治疗。方法 通过分子生物学 的方法，构建VEGF165低氧启动rAAV载体，采用磷酸钙和氯仿－PEG8000/NaCl －氯仿法构建低 氧启动rAAV病毒。通过体内外低氧诱导，验证VEGF165低氧启动rAAV对低氧的特异性。结果 体 内外试验证实VEGF165低氧启动rAAV仅在低氧诱导后表达具有生物活性的VEGF蛋白，对低氧具 有特异性。 关键词: 重组腺相关病毒；低氧启动 ；血管内皮生长因子 缺血性脑血管病是严重威胁人类健康和生命的常见病和多发病，致残、致死率均高。目前 缺少特异的有效治疗。转基因治疗缺血性血管病是一种新的尝试，越来越引起人们的重视。在 肢体和心脏缺血的治疗中，应用VEGF作为效应因子，在诱导血管新生、侧支循环的建立和功能 恢复方面已经已取得令人鼓舞的效果。本课题组从 1996 年开始从事缺血性脑血管病的基因治 疗，向大鼠脑缺血区转染VEGF165基因，治疗脑缺血。但是脑组织的特殊性决定了基因转染载体 必须是安全和高效的。重组腺相关病毒 （rAAV ）具有安全性好、宿主范围广、转染效率高等几 方面的突出优势，是目前中枢神经系统基因治疗的良好载体。但通用型rAAV采用巨细胞病毒 （CMV ）启动子，长期表达VEGF蛋白，缺乏调控，存在诱导血管过度增殖、形成血管畸形的 风险，并大大增加了促进潜在肿瘤生长的危险，在安全性方面尚存在一定的缺陷，如果采用低 氧启动rAAV ，使VEGF仅在缺血缺氧时表达，使用起来将更加安全。 1 材料和方法 1．1 材料 低氧启动 rAAV 载体为本实验室构建，并已验证其特异性和高效性。HEK293 T 细胞购自协和医科大学细胞中心，MEM 培养基为 GIBCO 公司产品，胎牛血清为 Hyclone 公司 产品。细胞培养采用 Orange 公司一次性用品。限制性内切酶为 TaKaRa 公司产品，T4DNA 连 接酶为 Promega 公司产品，DNA 胶上纯化试剂盒为 Clontech 公司产品。VEGF 多抗为 Santa cruz 公司产品，FITC 标记抗兔二抗购自中山生物制品公司。氯化三苯四氮唑 （TTC ）购 自北京市化 学试剂公司。大鼠立体定向头架购自上海第二军医大学。SD 雄性大鼠 10 只，体重最小 182g ， 最大 220g，平均 198.4 ±13.0g ；雄性豚鼠3 只，体重约在 350~450g ；以上动物均由北京协和医 基金项目：国家自然科学基金资助项目30271330 ） -1- 院实验动物中心提供。 1．2 方法 1.2.1 VEGF165低氧启动rAAV 的构建 采用EcoR I和Pst I双酶切、连接获得 VEGF 165-低氧启动rAAV载体。 1.2.2 低氧启动 rAAV 的构建 采用质粒磷酸钙共转染的方法，通过氯仿－ PEG8000/NaCl －氯仿法接合超滤纯化rAAV 病毒，采用蛋白电泳检测病毒外壳蛋白（1）。 1.2.3 VEGF165低氧启动rAAV体外诱导表达 将密闭塑料小盒置于 37℃ 孵箱内，小盒内持续通予 5 ％CO2+94 ％N2 混合气，平衡两小时左右，经氧浓度测定仪证实， 分别可得 0.2 ％氧浓度环境。VEGF165 低氧启动rAAV转染HEK293T细胞，转染 1h后，更换含 抗生素、正丁酸纳、2%胎牛血清的培养基，低氧培养 6h或 18h ，然后按正常氧浓度继续培养， 转染 48h后收集培养基上清、固定细胞用于下一步VEGF 的检测。 1.2.4 VEGF165低氧启动rAAV体内诱导表达 SD雄性大鼠 5 只，平均 198.4 ±13.0g 。采用