基因工程第8章克隆基因表达.ppt

宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。 位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。 1）农杆菌选择标记 2）最终受体植物的选择标记 ② 选择标记 卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素对植物有剧毒！） ③ 外源基因插入pGV3850的过程 外源基因 Kanr pBR322 土壤农杆菌 含pGV3850 植物组织 卡那霉素筛选 胭脂碱筛选 抗卡那霉素 的土壤农杆菌 外源基因 表达鉴定 转化 插入 感染 pBR322与pGV3850重组 整合到 染色体上 pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。 转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物 （2）双元载体（binary vectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点，是个穿梭载体。 Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（10kb） ①双元载体的结构 Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合） ②双元载体的转化 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。 受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。 1）基因插入 2）帮助质粒（ helper plasmid） Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。 左 右 外源基因 双元载体 Vir 帮助质粒 农杆菌 Vir 农杆菌 左 右 外源基因 感染植物 转化 左 右 外源基因 进入植物细胞核，整合，表达 E.coli （3）三亲融合法(triparental matig) 含双元载体的大肠杆菌： 含有外源基因和左右边界。 含有帮助质粒的辅助细菌： 含vir基因。 受体农杆菌（空）： 三种菌混合培养，然后通过各自的抗菌素抗性标记选择吸收了外源基因、左右界、和Vir的农杆菌。 三亲 四、在哺乳动物细胞中表达 1.动物细胞基因克隆和表达载体---SV40病毒 常用的SV40载体，是从猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而来的。 ① 20面体外壳： 由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成。 5243bp的环状双链。 ② DNA： （1） SV40病毒的结构 SV40 猿猴细胞 细胞裂解 释放SV40 啮齿类细胞 细胞癌变 SV40DNA整合到寄主染色体上 受纳细胞 非受纳细胞 （2）SV40感染和生存方式 T-抗原（tumor antigen）: 两个6聚体的T抗原结合在SV40 DNA的复制起始点上，分别向相反方向移动，将双链DNA解螺旋。 随后单链DNA结合蛋白（ssB）与解开的单链DNA结合维持解旋状态。 (3) SV40 DNA的复制 ①解链 SV40编码的蛋白。功能是在SV40 DNA复制的时候解开DNA双链。 T抗原 SV40 DNA双链 ② SV40 复制起始位点 5’-CTCACTACTTCTGGAATAGC 3’-GAGTGATGAAGACCTTATCG 1 20 早期回文序列 TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCT AGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA 21 47 T抗原结合位点 GCATAAATAAAAAAAATTAGTC CGTATT TATTTT TTTTAATCAG 富含AT区 48 69 ①早期表达区： (4) SV40病毒的转录和翻译 编码大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原。 ②晚期表达区： 在DNA复制一段时间后表达，产物是VP1、VP2和VP3三种外壳蛋白。 对非受纳细胞（non permissive cells），只有T 抗原表达，随后病毒基因组随机整合到宿主染色体上。 SV40 整合 (5) SV40病毒的整合 有严格的包装限制。如果插入的外源基因过大，就无法包装。 (6) SV40病毒的包装 ①去掉一部分DNA(T抗原或者VP基因）。 ②助手型SV40 去掉T抗原基因的病毒，保留晚期表达区（外壳蛋白）。 提供外壳蛋白。 (7) SV40基因组的改造 不能复制，但能包装。 需要这两种缺陷型病毒混合感染，才能互补。既能使插入SV40的外源基因复制，又能使外源基因被包装进病毒颗粒，得以扩增。 去掉VP基因，插入外源基因的病毒，保留早期表达区[编码大T抗原（控制DNA复制）和小t抗原]。不能包装，但能复制。 ③重组型SV40 ④包装重组型SV40 提供重组DNA和T抗原。 助手型SV40: 提供VP外壳蛋白。 重组型SV40： 提供T抗原。 包装成的病毒颗粒中，既有含外源基因的重组型，又有助手型DNA。 (