PCR技术详解教学提纲.pptVIP

PCR技术详解;一;;二、定义 PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外高温（95℃左右）??变性成单链，低温退火（经常是60℃左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5’~3’)的方向延伸合成互补链;三、基本原理? PCR技术模拟DNA 的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物, 该原理主要包括3个基本反应过程：模板变性———引物退火———新链延伸;;理想拷贝数=2n n：循环次数 实际拷贝数=(1+x)n X：平均效率,约为0.85 n：循环次数 ;四、反应要素;热稳定DNA聚合酶 ;2. 引物 引物是PCR特异性反应的关键, PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度一般为0.1-0.5 ?mol/L，浓度过低影响产量，偏高引起错配和非特异性产物增加，且可增加引物二聚体的产生几率;④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带； ⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； ⑥ 引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过2~3℃，经验公式Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)，引物的退火温度通常低于Tm值5~10℃； ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； ⑧引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 0.5μM，以最低引物量产生所需要的结果为好 —引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 ;3. 模板;4. dNTP;5. 二价阳离子;6.维持pH的缓冲液;五、PCR的类型;1)反向PCR (reverse PCR) ;;2）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般是0.01∶0.5μM，关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究; ;3）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称为多重PCR。其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。;4）实时定量PCR(real-time PCR): 该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程每一轮循环产物的累积荧光值，可以很好的推算模板的起始浓度;探针设计一般应符合以下条件： ①探针长度应在20～40个碱基左右，保证结合特异性。 ②GC碱基含量在40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。 ③避免与引物发生杂交或重叠。 ④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。 另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。;6、PCR反应流程;① 变性温度与时间：;③ 延伸温度与时间：;2、循环次数;七、PCR产物检测;八、常见问题分析;九、PCR技术应用领域;谢 谢 观 赏