甲基化检测原理和步骤.doc

PAGE PAGE 4 DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤 修饰设计：使用CpGenomeTMkit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯