化学发光法与连苯三酚自氧化法消除O2—自由基可靠性的比较.docVIP

PAGE PAGE 1 化学发光法与连苯三酚自氧化法消除O2—自由基可靠性的比较 　　【摘要】本实验利用化学发光法和连苯三酚自氧化法测试了五种抗氧化剂对O2?自由基的消除作用，结果表明同种抗氧剂相同浓度下不同反应体系对O2?自由基消除率相差很大，比较了不同反应体系的吸收光谱说明两法测试结果的区别，对化学发光法与连苯三酚自氧化法的可靠性进行了对比。 　　【关键词】化学发光法；连苯三酚自氧化法；氧自由基 　　1.引言 　　近年来，药学及其有关学科的迅速发展使药学的研究领域不断扩大且日益广阔和繁荣。在现代药学的各个学科中，临床医学和生命化学领域中的自由基理论的研究及其在医学科学中的应用，是药学新领域研究的重要发展。 　　随着年龄的增长，生物体内产生抗氧剂和抗氧化酶能力逐渐下降。自由基代谢平衡紊乱，过多的自由基会通过各种作用使机体受损而导致各种疾病或加快衰老。因此，如何有效清除自由基就显得尤为重要，而O2?自由基是其中常见的一种。目前，国内外对消除O2?自由基的测定方法很多，主要有：连苯三酚自氧化法、化学发光法、肾上腺素法、极谱电极法等，本文主要通过五种抗氧化剂来研究化学发光法与连苯三酚自氧化法对O2?自由基消除作用，从而比较两法的可靠性。 　　2.实验部分 　　2.1试剂与仪器 　　试剂：茶多酚、苯甲酸、芦丁、芸香叶苷、槲皮素、连苯三酚、NaCO3、NaHCO3、HCl、Tris（三羟基甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二胺四乙酸二钠），以上均为国产分析纯；鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）为德国Merck-Schuchrdt公司产品；所用水均为二蒸水。 　　仪器：化学发光仪、pH数字酸度计、UV-754紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂）。 　　2.2溶液的配制 　　2.2.1配制苯多酚等溶液 　　（1）称取一定量的槲皮素、苯甲酸、芦丁、芸香叶苷等，用乙醇水溶液（体积比为4：6）溶解定容，配制浓度分别至：100mg/25mL、100mg/10mL、20mg/10mL、50mg/10mL；称取一定量的茶多酚，用水溶解定容至浓度为100mg/10mL。 　　（2）缓冲液的配制 　　称取NaCO35.3g、NaHCO34.2g，用二蒸水分别定容至500mL，按两者体积比6：4配制成500mL的溶液，用pH计调整至pH=10.16。 　　称取Tris0.6057g，EDTA0.149g，用二蒸水分别定容至500mL，再取0.1mol/LHCl22.9mL，混合均匀后，用用二蒸水定容至100mL，调整pH=8.2。 　　（3）5mmol/L鲁米诺溶液的配制 　　称取0.0442g鲁米诺，加入少量三乙胺，再用pH=10.16NaCO3-NaHCO3缓冲液定容至50mL，放置三天后备用。 　　（4）10mmol/LHCl的配制 　　先量取浓HCl5mL稀释至100mL，再移取3.33mL定容至200mL即可。 　　（5）6mmol/L连苯三酚溶液的配制 　　称取连苯三酚0.0378g，用10mmol/LHCl定容至50mL。 　　3.实验方法 　　3.1化学发光法 　　先启动发光仪预热两小时，在测定管中加入鲁米诺溶液1.6mL，加入不同溶液的待测液0.04mL，再加入连苯三酚0.2mL，混合反应，待10s后，测定器5s内发生强度的平均值，求出抑制率。 　　3.2连苯三酚自氧化法 　　（1）自氧化法曲线的测定 　　按下表要求加样，迅速摇匀，立即加入比色皿中，在420nm处测其吸光度，每分钟一次，共测5分钟，平行三次，求出自氧化曲线。 　　（2）抗氧化性的测定 　　按下表加样，调整X的数值，以调节抗氧剂的量，测定不同浓度下的曲线，求出他们的斜率。 　　（3）抗氧化剂抑制率的测定 　　抑制率=（A0-AS）/A0% 　　其中A0为自氧化曲线斜率，AS为加抗氧化剂后的曲线斜率。 　　4.实验结果 　　4.1抗氧化剂对O2-的消除作用 　　4.1.1茶多酚对O2-的消除作用 　　化学发光法连苯三酚自氧化法 　　4.1.2苯甲酸对O2-的消除作用 　　化学发光法连苯三酚自氧化法 　　4.1.3芦丁对O2-的消除作用 　　化学发光法连苯三酚自氧化法 　　4.1.4芸香叶对O2-的消除作用 　　化学发光法连苯三酚自氧化法 　　4.1.5槲皮素对O2-的消除作用 　　化学发光法连苯三酚自氧化法 　　5.讨论 　　5.1各物质对O2-的最大消除率的比较 　　化学发光法是应用自氧化反应产生的O2-，而O2-与化学发光剂鲁米诺反应产生电子激光态的中间产物，当其返回基态时即发光，当抗氧化物存在时由于歧化反应而发光。自氧化法是由于自氧化反应属于游离基链反应，自氧化过程产生O2-，抗氧化物通过消除O2-降低了自氧化反应的总速度，其氧化产物在一定的波长处表现特征吸收，基于上述机