HPLC高效液相色谱.ppt

固 定 相 离子交换剂的基质有三大类: 合成树脂?聚苯乙烯?，纤维素和硅胶。 流 动 相 离子交换色谱通常在水介质中进行，为了增加带有较大有机基团的分子的溶解度，可采用水-乙醇混合溶剂作为流动相，有时甚至全部采用有机溶剂。 在离子交换色谱中，常通过改变流动相中反离子的种类和浓度及流动相的pH等来控制k值，改变选择性。 总体来说，pH 增加，在阳离子交换色谱上试纸保留值降低，而在阴离子交换色谱上试样保留值增加，这主要是与有关组分的解离度有关。一般说来，最好将pH选在酸碱的pKa值附近。 离子色谱法?1? 双柱离子色谱或抑制型离子色谱 在分离柱与电导检测器之间增加一根抑制柱，柱中填充的离子交换树脂所带电荷与分离柱相反。经分离后的流出液首先通过抑制柱，进行抑制反应，除去洗脱剂中离子，在进入电导检测器中检测，获得扣除流动相背景的电导值。 优点是降低了流动相的总离子含量，提高检测试样离子的灵敏度。缺点在于抑制柱必须再生，并且由于抑制柱的存在而使色谱峰展宽，导致分辨率下降。 单柱离子色谱或非抑制型离子色谱 它只有一根分离柱，不用抑制柱，故流动相直接由分离柱流到电导检测器。单柱离子色谱法一方面是采用低浓度洗脱液，以降低洗出液的本底电导，另一方面是采用低容量的离子交换树脂，使保留值保持不变。 单柱离子色谱法因减少了抑制柱带来的死体积，分离效率高，且能用普通HPLC仪改装。主要缺点是难以在高电导介质中测定低含量试样粒子。 离子色谱法?2? 离子排斥色谱 离子排斥色谱可以通过离子交换剂中的氢离子将弱酸的盐转换成相应的酸来分离弱酸的盐。同理，也可采用羟基型的阴离子交换剂分离弱碱的盐。 主要应用在鉴定和测定许多酸性物质，如牛奶，咖啡，酒及许多其它商业产品。 在分离羧酸时，是以稀HCl溶液为洗脱剂，以银离子形式的阳离子交换树脂柱为抑制柱，并用电导检测器检测。银离子与氯离子反应除去了冲洗剂中的氯离子。被分析的物质中未离解的酸，因不带电荷被排斥于离子交换剂之外。 尺寸排斥色谱 ?size-exclusion chromatography? 原理 色谱柱填料和流动相 应用 原 理 尺寸排斥色谱也称为凝胶色谱。与其它液相色谱方法不同，它是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 凝胶色谱的填充剂是凝胶。它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。用这种填料填充的柱子的总体积 VA 为: VA = Vg + Vi + Vo 式中Vg 是填料骨架的体积; Vi是填料孔体积; Vo 是填料颗粒之间的体积。孔体积Vi中的溶剂称为固定相，而在粒间体积Vo中的溶剂称为流动相。 凝胶的孔穴大小与被分离的试样的大小相当。对于那些太大的分子，由于不能进入孔穴而被排斥，所以随流动相移动而最先流出。小分子则完全相反，它能渗入大大小小的孔隙中而完全不受排斥，所以最后流出。中等大小的分子则可渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排斥，所以介乎上述两种情况之间。 特 点 保留时间是分子尺寸的函数，因此有可能提供分子结构的某些信息。 保留时间短，谱峰窄，容易检测，可用灵敏度较低的检测器。 固定相与分子间的作用力极弱，趋于零，即柱子不能很强地保留分子，因此柱寿命长。 不能分辨分子大小相近的化合物。一般说来，分子量的差别需要10%以上时才能得到分离，所以这个方法不能分离复杂的混合物。它主要用来获得分散性聚合物的相对分子质量分布情况。 色谱柱填料和流动相 色谱柱用凝胶填料分为有机和无机两大类。前者如交联聚苯乙烯，后者如多孔硅胶和多孔玻璃等。一般来说，有机凝胶的柱效较高，但热稳定性，机械强度和化学惰性较差，易老化，且使用条件要求高；无机凝胶的柱效稍差，但可长期使用，性能稳定。 选择流动相的主要依据是: 在分离温度下具有低的粘度。其沸点通常比柱温高20 ? 50°C。 能完全溶解试样。 溶剂与检测器匹配，以使检测器提供较高的灵敏度。 必须考虑流动相对凝胶的影响。例如: 聚苯乙烯型的凝胶不能用丙酮，乙醇作流动相。 应 用 凝胶过滤色谱: 用水溶剂和亲水填料，分离水溶性试样； 凝胶渗透色谱: 以非极性有机溶剂和疏水填料，分离在极性小的有机溶剂中溶解的物质。 主要用来分离相对分子质量高?? 2 000?的化合物，如有机聚合物，硅化物以及从低分子量物质或盐中分离天然产物等。随着填充剂的发展，也在水或非水系统中分离有机或者无机小分子化合物。 通过测定相对分子量和相对分子质量分布来鉴定高聚物。 可用于研究聚合机理，选择聚合工艺及条件，并考察聚合材料在加工和使用过程中相对分子质量的变化等。 在未知物的剖析中，凝胶色谱作为一个预分离手段，再配合其它分离方法，能