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第9章 转基因动物 与生物反应器 9.1 转基因技术 通过人工操作的方式将外源基因整合到 生物体基因组内，使该转基因生物能稳定 地将此基因遗传给后代的实验技术。 细胞转染外源基因分三步： (1)选择合适的受体细胞; (2)有效的转染方法； (3)转化后的筛选。 细胞转染外源基因的方法： 一、物理方法 (图） 1、电穿孔法 2、显微注射法 3、裸DNA直接转移法 2、显微注射法：（P253）主要用于制备转基因动物。用微吸管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。 3、裸DNA直接转移法：效率低。 二、化学方法 1、DEAE-葡聚糖介导法：效率低 (乙二胺乙基葡聚糖) DNA上的磷酸带负电 DEAE带正电 → DNA大颗粒→ 细胞胞饮 2、磷酸钙-DNA共沉淀法：效率低(P254) 三、生物学方法 ——病毒介导法：DNA病毒载体， 反转录病毒载体。 9.2 转基因动物 9.2.1 转基因动物的制备 一、步骤： ?外源目的基因的制备； ?目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞； ?选择获得携有目的基因的细胞； ?选择合适的体外培养系统和宿主动物； ?转基因细胞胚胎发育及鉴定； ?筛选所得的转基因动物品系。 二、目的基因导入的方法 1、原核期胚胎显微注射法（图） 优点：技术成熟；外源DNA分子大小不受限 制，整合效率较高（小鼠10-40%，鱼 10-75%，猪0.98%，羊0.1%） 缺点：生产大动物比小动物更困难. 设备昂贵；易损伤受精卵；整合位点 随机;结果要等到子一代出生后经过选 择才能确定. 2、反转录病毒感染法： 将目的基因重组到逆转录病毒基因组上，人为感染着床前或着床后的胚胎. 优点：效率较高，感染率可达100%。 缺点：外源基因大小受限制； 安全性问题一直有争议。 3、胚胎干细胞介导法：把外源DNA导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表达好的转化细胞系，将细胞注入受体囊胚腔中，移植到假孕动物子宫内，生下的个体还要通过杂交繁育，才能得到纯合的转基因个体。 4、精子载体导入法： 将外源目的基因导入精子，再进行人工授精或体外受精等方法。 5、人工酵母染色体法（YAC） 技术途径为： ①ES细胞转染YAC后体外筛选，将阳性ES细胞注射入囊胚腔 ②YAC原核微注射。 特点：能保证巨大基因的完整性。 6、受精前卵细胞显微注射法 将外源DNA克隆至反转录病毒载体，再注射进卵细胞的卵周腔。 7、细胞核移植技术 将体细胞核移植技术与转基因技术结合,使转基因动物的群体迅速被克隆扩大。 技术要点：外源目的基因转染动物体细胞→ 选择阳性体细胞作核供体→ 移植到去核卵母细胞中进行动物克隆。 优点：后代多数为转基因个体；核移植 前可以选择后代性别。 缺点：难度大、成功率低、胎儿成活率 不高。 三、转基因动物的鉴定 PCR或斑点印迹法: 检测注入基因是否整合 Western印迹技术: 检测组织或血液中的特异性蛋白， 以确定导入基因是否表达。 9.2.2 转基因动物技术的意义 一、改良动物品种 应用：提高生长速度；改良动物肉质和乳 质；提高羊毛产量和性能；培育抗 病品种等。 1984年中科院水生生物研究所研制出世界上 第一批转基因鱼： 草鱼生长基因→ 鲤鱼→ 三倍体。 环球基因药物公司正致力于用转基因奶牛生产人乳铁蛋白，实现动物生产人乳的愿望。 二、建立转基因动物模型，用以研究基因治疗。 如：镰刀型贫血症、自身免疫病、 老年性痴呆症等的转基因小鼠模型 已建立。 基因治疗：将功能性基因导入患者体内，抑制、替代或补偿缺陷基因。 分为 生殖细胞基因治疗、 体细胞基因治疗。 三、生物制药 目前已构建成转基因动物十几种，利用转基因动物来生产一些药用蛋白已实现商品化。 尿激酶、干扰素、人生长激素、α-抗胰蛋白酶、凝血因子、纤溶酶原激活剂、人型化单克隆抗体等。 *英国PPL公司曾培育出一只转基因羊，其乳腺系 统可高效表达人的α-抗胰蛋白酶，20g/L羊奶， 国际市场售价10万美元/g。但有性繁殖后代性状 出现分离，产量仅为原羊的1/10。