j第八章目的基因的表达.ppt

第八章 克隆基因的表达 一、基因表达： 二、克隆基因的表达： 第一节 外源基因在原核细胞中的表达 一、原核生物基因表达的特点 3. 转录和翻译偶联、连续进行。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence: 二、原核表达系统的注意事项! 三、原核生物基因表达的调控 consensus sequences ① -35box 原核启动子共有序列的功能 （2）翻译的起始位点 ii）起始密码： 2. 转录终止子 原因： （2） 乳糖启动子lac （3）色氨酸启动子trp 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 2. 周质中表达 （3）常用的原核信号肽 （2）真核信号肽 3. 胞外表达 五、几种类型的原核表达载体 （1）pKK223-3 载体P87 2. 分泌型表达载体P92 pIN III-comA1 3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列P90 （3）产物提纯 （4）产物分离 pGEX （5）其他融合蛋白系统P91 六、影响外源基因表达效率的因素 （2）-35区与-10区之间的距离 2. 翻译起始序列对表达效率的影响 （2）起始密码AUG （3） 其它 4. 转录终止区对表达效率的影响 七、提高表达水平常用的方法 ?PL启动子是温度诱导型 tac启动子是药物诱导型 （2）表达载体诱导复制 （1）设计成融合蛋白 （2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 （3）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件： 九、外源蛋白质表达后的正确修饰 人胰岛素分子 2. 前体切割 3. 蛋白质糖基化 4. 氨基酸残基的修饰 十、原核细胞表达的缺陷 第二节 外源基因在真核细胞中的表达 一、在酵母中表达P275 （1）整合型载体(YIp) 特点： （2）复制型载体(YRp) ARS 特点： （3）着丝粒质粒(YCp) （4）附加体型载体(YEp) 2?m质粒： 特点： 2. 酵母转化和表达的一般过程 3. 酵母表达系统的特点 （2）缺点 4. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白 5. 在啤酒酵母中表达外源蛋白的方式 （2）表达分泌型蛋白 信号肽的切割： 6.其它酵母表达系统 ②表达载体构建（整合型）： 整合到染色体中 （2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达 二、昆虫培养细胞表达系统 ②多面体形式 （2）杆状病毒的表达特点 3. 转化子筛选 4. 杆状病毒转化载体 转移载体 （2）杆状病毒载体转化过程 4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白 5. 杆状病毒大规模表达存在的问题 三、外源基因在植物中表达 Ti plasmid （1）Ti质粒的结构 ①T-DNA（transfer-DNA） 细胞分裂素基因 冠瘿碱（opine）的类型和化学结构 冠瘿碱（opine）的作用 ②毒性基因（vir） ③冠瘿碱代谢基因 2. 农杆菌的感染和生存 3. Ti质粒的种类 （2）胭脂碱（nopaline）型质粒 4. Ti质粒转化的对象 6. 天然Ti质粒作载体的缺点 7. Ti质粒的改造 改造后的Ti质粒载体模式 8. Ti载体的类型 ② 选择标记 ③ 外源基因插入pGV3850的过程 转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物 （2）双元载体（binary vectors） ②双元载体的转化 （3）三亲融合法(triparental matig) 四、在哺乳动物细胞中表达 （1） SV40病毒的结构 （2）SV40感染和生存方式 (3) SV40 DNA的复制 ② SV40 复制起始位点 (4) SV40病毒的转录和翻译 (5) SV40病毒的整合 (7) SV40基因组的改造 (8) SV40混合传染过程 (9) COS细胞 (10) SV40 DNA载体 pSV2的特点： pcDNA3 pcDNA3.1 pcDNA3.1CAT 2. 人乳多空BK病毒载体 基因工程总结 （1）分子量太大（120kb）！ （2）限制性酶切位点太多。 （3）被转化的植物细胞成为肿瘤，不能 再分化。 （4）在大肠杆菌中不能复制。 （4）冠瘿碱合成对于植物无意义。应剔除掉。 （5）加入大肠杆菌的ori和选择标记。 （6）加上真核生物的转录信号和结束信号以 及添加polyA的信号序列。 （1）保留T-DNA的转移功能部分（vir基因， 左右边界）。 （2）减少限制性酶切位点，引入单一插入位 点。 （3）取消T-DNA的致瘤基因，使被转化的植 物细胞不再成为肿瘤，能正常分化。 left right M C S AMPr ori Vir select （1）共整合载体（cointegrate vectors） 最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时