4第四章PCR法获取目的基因.pptVIP

* PCR法获取目的基因 * * PCR法获取目的基因 * 4.注意事项 PCR应该在一个没有脱氧核糖核酸污染的干净环境中进行，最好设立一个专用的PCR实验空间。 纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。 所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。 PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。 试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。 试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。 PCR的样品应在冰浴上融解，并且要充分混匀。 * PCR法获取目的基因 * 阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。 阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。 * PCR法获取目的基因 * 阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括①标本对照:经确认的阴性标本 ②试剂对照:在PCR反应混合物中不加模板，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染（能控制贮存试剂可能出现的污染或加样器被DNA模板的气溶胶污染）。 * PCR法获取目的基因 * 5.防止污染的方法 合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。 吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。 * PCR法获取目的基因 * 预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。 防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性使用。 设立适当的阳性对照和阴性对照。 * PCR法获取目的基因 * 减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。 * PCR法获取目的基因 * 6.实验举例 本实验以含有小鼠基因T10的质粒pCMV-Myc-T10为模板，扩增约800bp的产物。 * PCR法获取目的基因 * PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等 TaKaRa Taq (5U/μ l) 10×PCR缓冲器 (含Mg 2+) dNTP混合(各2.5 mmol/L) 模板 (10ng，质粒) 引物（P1和P2, 10 mmol/L) 实验仪器及材料 10×PCR缓冲液： (100 mmol/L Tris-HCl, pH8.3, 500 mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2) * PCR法获取目的基因 * Insert EcoR1 Xho1 pCMV-Myc-T10 * PCR法获取目的基因 * P1: 5’TTCCAAGCTTCACCATGGCATCAATG CAGAAG C 保护性碱基 Hind III Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝ 4×12＋2×11＝70 ℃. P2: 5’TCGCGGATCCAGTGGCAGCTT GCTAATCTCATTG 保护性碱基 BamH I Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝ 70 ℃. * PCR法获取目的基因 * PCR混合(50 μl): 模板: 1 μl (10ng) P1: 1 μl (10mmol/L) P2: