分子遗传学第7章 基因突变与重组.ppt

突变(mutation)：可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。突变是一种遗传状态，是相对于正常状态而言 突变体(mutant)：携带突变基因的生物个体或群体 遗传突变：包括核苷酸点突变和染色体突变（染色体数目和染色体结构的改变) 点突变：在一个基因内部发生的一个或数个核苷酸对的增加、缺失或取代，称为点突变 基因突变的时期 突变可以发生在生物个体发育的任何时期，性细胞发生的突变可以通过受精直接传递给后代 体细胞如果发生突变，突变的体细胞在生长过程中，往往竞争不过周围的正常细胞，受到抑制或最终消失 保留体细胞的突变，需将它从母体上及时分割下来加以无性繁殖，许多植物的突变就是体细胞的突变结果。如果果树上一旦发生优良突变，即可直接采用无性繁殖方法育成新品种 大剂量的UV照射；相邻的两个T或两个C或C和T之间均可以形成嘧啶二聚体，最容易形成的是TT二聚体 在人皮肤中，每小时由于UV而产生嘧啶二聚体的频率为5×104／细胞 UV因穿透力有限，对于人的作用仅限于皮肤，但可以影响微生物的存活 发生在复制后；易错修复 重组修复负责消除那些未被切除的二聚体可能造成的可怕后果 在重组修复过程中，二聚体并未除去，而是经过多次复制后，二聚体被稀释，不妨碍正常代谢 所需酶在正常的细胞中就存在： RecA、RecBCD蛋白； DNA polymerase； ligase RecA蛋白具有催化DNA分子之间的同源联会和交换单链的功能 发生在复制后；易错修复 SOS修复系统的存在是紫外线诱发突变的主要原因 SOS修复是一种旁路系统，允许新生的DNA链越过T T而生长，代价是保真度的极大降低，是一个错误潜伏的过程 其原则是：丧失某些信息而存活总比死亡好 当SOS修复系统被活化后，校对系统大大丧失了识别双螺旋结构变形的能力，结束了空耗过程，而使复制继续前进 SOS系统的酶只有细胞受到损伤时才出现 以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修饰系统，两种不同来源的－噬菌体（lK和lB）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。 限制性内切酶的类型 （4）加入酶量??在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。但实验中常常出现酶量加入过多酶切效果却反而差的现象，这主要是酶的储存液中含有50％的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10％时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10％，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star活性）。 （5）DNA纯度??在满足上述条件下影响酶切效果的主要因素是DNA的纯度，DNA样品中蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）的残留、高浓度的RNA等。另外DNA浓度过高也会导致酶切失败，一般DNA的质量浓度在1mg/ml体系中能取得好的酶切效果。当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大（如从15ul--30ul），将杂质相对浓度稀释，这样不需多增加酶量就能取得较好的酶切效果 酶切方式可分为部分酶切与完全酶切： （1）部分酶切??指的是同一DNA片段上的位点有些被切开而另一些未被切开，此法主要用于基因的克隆。在某些基因内部可能有此酶的切点，用完全酶切进行克隆时难以得到完整基因。部分酶切实施方法：a）在不同的时间从同一个酶反应管中取样终止反应，利用时间控制酶切程度，该方法比较繁琐，不易掌握得恰到好处；b）固定酶切的反应温度和反应时间，控制酶的投入量，一般是在反应管中加入不等量稀释的酶，利用不同酶浓度控制酶切程度，该方法因易控制而被广泛应用。 （2）完全酶切??适用于除目的基因克隆以外的绝大多数DNA操作，例如载体的切割，酶切图谱的制作，基因的鉴定与DNA片段的分离等。  在DNA重组实验中，经常会用双酶切（甚至是3个酶切鉴定）鉴定重组子或获得不同粘性末端的DNA片段，而在厂商提供的联合酶切缓冲液表中并不包括所有类型的酶，即使提供了“万能缓冲液”，有些酶的联合酶切也不一定能取得比较好的效果。 解决方法： （1）分步酶切法??对将进行的两种酶的酶切采用分步的方法，即先选择一个酶，采用此酶的最佳反应条件进行酶切，然后选用第二个酶进行最佳反应。此方法通用性较强，联合酶切也比较完全，但较耗时。 （2）?同步酶切法??取两种酶的最佳缓冲液各50％加入到酶切反应体系中，并同时加入两种酶进