LH-20装填和使用说明.doc

Sephadex LH-20 装填指南 Sephadex LH－20 是由葡聚糖G-25羟丙基化工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等，Sephadex LH－20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，即可用于初步纯化步骤，也可用与最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。 制备凝胶悬浮液 装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一（粒径分布越窄），越容易获得稳定均一的柱床。但是对于Sephadex LH－20而言，25～100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底清洗。 Sephadex LH－20在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。 1． 在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统，请参考后页之胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量。2． 使溶胀的胶体积沉淀之后占总体积的75％，上层溶剂占25％，这时，悬浮液从一个容器倒入另一个容器时胶粒可移动。 3．将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。 表一 干胶溶胀表 溶 剂 床体积（mL凝胶/g干胶粉末） Dinethyl sulphoxide 二甲亚砜 4.4～4.6 Pyridine 嘧啶 4.2～4.4 Water 水 4.0～4.4 Dimethylformamide 二甲基甲酰胺 3.8～4.2 Saline 生理盐水 3.9～4.1 Methanol 甲醇 3.8～4.1 Methane dichloride 二氯乙烷 3.8～4.1 Chloroform1 氯仿 3.8～4.1 Propanol 丙醇 3.7～4.0 Ethanol2 乙醇 3.6～3.9 Isobutanol 异丁醇 3.6～3.9 Formamide 甲酰胺 3.6～3.9 Methylene dichloride 二氯甲烷 3.6～3.9 Butanol 丁醇 3.5～3.8 Isopropanol 异丙醇 3.3～3.6 Tetrahydrofuran 四氢呋喃 3.3～3.6 Dioxane 二氧杂环乙烷 3.2～3.5 Acetone 丙酮 2.4～2.6 Acetonitrile3 乙腈 2.2～2.4 Carbon tetrachloride 四氯化碳 1.8～2.2 Benzene 苯 1.6～2.0 Ethyl acetate 乙酸乙酯 1.6～1.8 Toluene 甲苯 1.5～1.6 1．包含1％的乙醇。 2．包含1％的苯。 3．溶胀胶体积小于2.5mL／g的溶剂没有使用价值。 平衡 上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。 洗脱液 为确保延长层析柱的使用寿命，所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。 样品 样品体积应该占柱总体积的1-2％，同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤。 洗脱 洗脱流速应根据情况而定，最大线流速约12cm／min（反压1.5ba），建议流速为1-10cm／h。总体来说，较低的流速，具有较高的分辨率。 再生 凝胶再生通常事先用2-3个柱体积的洗脱液进行清洗，如果换洗脱液，则需要重新平衡。 体积流速与线性流速的关系 线性流速＝体积流速／横截面积 溶胀体积 由于Sephadex LH－20的溶胀体积依赖于溶剂，所以对于不同直径的柱可根据比例增加或减少旧柱体积以便计算出新体积。 新体积＝旧体积×（新柱体积／旧柱体积） 胶的性质 Sephadex LH－20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性再分离过程中起着重要作用。 ????? 排阻极限 4－5KD（与所有溶剂有关） 上样量 ? 吸附模式 取决于所需分辨率 分子量大小 小于总体积的20％ 正相分配 小于总体积的1％ 胶粒形状 球形，多孔 颗粒大小（干） 18－111um（直径） 颗粒大小中间值（干） 70um（直径） 颗粒大小（甲醇） 27－163um（直径） 颗粒大小中间值（甲醇）