酵母感受态制备及转化步骤.docxVIP

一、酵母感受态细胞的制备 1. 在YPDA培养基上接种酵母AH109菌株，培养时间≤4周，菌落直径为2-3 mm，在15 mL离心管中加入3 mL新鲜的YPDA液体培养基，每个离心管中一个菌落，30 ℃，250 rpm，8 h。 2. 吸取10 μL 种子菌加入到含有50 mL YPDA的250 mL 三角瓶中，30 ℃，250 rpm，16-20 h。测OD600=0.15-0.3，将培养液移至50 mL离心管中，室温，700 g离心5 min。 3. 弃上清，用100 mL YPDA液体培养基重悬菌体，用500 mL三角瓶摇，30 ℃，250 rpm，3-5 h。 4. 测OD600=0.4-0.5，将菌液分装到2个50 mL离心管中，室温，700 g离心5 min。 5. 弃上清，每管中加入30 mL去离子超纯水，重悬菌体，700 g离心5 min。 6. 弃上清，用3 mL 1.1×TE/LiAc 悬浮菌体，吸出分装到2个1.5 mL离心管中，12000 rpm 离心15-30 s。 7. 弃上清，每管中加入600 μL 1.1×TE/LiAc重悬菌体，备用。 注意：制备出的感受态必须马上使用。 YPDA 胰蛋白胨（注：与LB培养基中的不同） 2 g 酵母提取物 1 g 麦芽糖 2 g 硫酸腺嘌呤 8 mg Agar 1.8 g 121 ℃ 20 min pH 5.8 100 mL 10×TE（100 mL）: Tris 1.21 g EDTANa?2H2O 0.37 g dd H2O 80 mL HCl调pH 7.5 定容 10×LiAc（100 mL）: LiAc?2H2O 10.2 g ；dd H2O 80 mL HCl调pH 7.5 定容 1.1×TE/LiAc：10×LiAc 1.1 mL 10×TE 1.1 mL dd H2O 7.8 mL 二、酵母共转化 1. 在1.5 mL离心管中加入：两种质粒各200 ng 3-5 μL已变性的鲑鱼精DNA 100 μL酵母感受态 600 μL新配制的PEG/ LiAc，轻轻混匀（可吸打） 2. 30 ℃热板放置30 min，每10 min混匀一次。 3. 加入70 μL DMSO，缓慢混匀（caution：一定要缓慢）。 4. 42 ℃热板热击20 min，每5 min缓慢摇匀一次（caution：一定要缓慢）。 5. 12000 rpm 离心15-30 s，弃上清。 6. 加入150 μL YPD plus，30 ℃热板放置30 min或者30 ℃，250 rpm，30 min。 7. 12000 rpm 离心15-30 s，弃上清。 8. 用600 μL 0.9 %（w/v）NaCl悬浮菌体。 9. 涂于二缺板 10. 吸取5μL点在相应的缺陷平板上，每个组合按照10倍或5倍梯度稀释点2-4个点。 11. 30 ℃培养2-3 d PS: 鲑鱼精DNA变性方法：100 ℃热板变性10 min，冰上冰冻10 min，如此反复一次，冰上备用。 50% PEG（100 mL）: PEG 3350 50 g，dd H2O定容至100 mL。 1×PEG/LiAc：10×LiAc 1 mL 10×TE 1 mL 50% PEG 8 mL