酵母单杂交系统及其应用.docVIP

酵母单杂交系统及其应用 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。 酵母单杂交技术的原理 酵母单杂交技术最早是1993年由Li et al从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控.?? 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研究表明GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成：(1)将文库蛋白片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒；(2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒.在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化入报告株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来。酵母单杂交技术的应用 酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在结构和功能上是由独立的DNA结合结构域和DNA激活结构域组成的基础上，这使得研究者可以构建不同的基因融合体，在酵母中表达融合蛋白，以同时结合特异的目的基因和激活转录. 理论上，在酵母单杂交技术中，任何目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋白。目前,酵母单杂交技术的应用可以归纳为以下二类：鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因；对DNA结合结构域进行分析。 实验方法： 诱饵质粒的构建 根据目标DNA 的序列，设计PCR引物，进行连续延伸PCR合成多拷贝顺式元件，并使PCR产物两端含有适当的限制性酶切位点。为减少合成过程中出现碱基突变，PCR过程中使用的耐高温聚合酶应为高保真聚合酶。 PCR产物的回收、纯化（按试剂盒）。 将PCR片段经限制性酶切后后插入pBluescript II SK载体，转化E.coli，挑取白色菌落，在含50μg/ml 氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜。 裂解法小量抽质粒，取3μl DNA用上述两种限制性内切酶消解，电泳分析是否有正确的插入片段。 利用2 MNH4AC法纯化质粒，测定插入DNA序列。 将测序正确的插入片段酶切后回收，插入酵母单杂交体系的鱼饵质粒pLGΔ-265UP1，替换其中的顺式元件CCAAT盒。 构建好的鱼饵质粒带有LacZ报告基因、尿嘧啶（URA）选择标记和2μ复制序列，该质粒是大肠杆菌-酵母穿梭载体。细菌的报告基因由CYC1的基本启动子控制，而含顺式元件的DNA片段作为鱼饵，位于CYC1基本启动子上游。 将鱼饵质粒pLG-PRm转化到酵母菌株EGY48，转化子在尿嘧啶缺陷的SD培养基平皿上培养3-5天。 制备含有诱饵质粒的酵母菌株感受态。 将50μg含含目的基因的cDNA库质粒DNA转化到感受态细胞中，在尿嘧啶和色氨酸缺陷的SD培养基平皿上培养3天。 利用硝酸纤维膜从平板上将所有的转化子影印到含有X-gal平板上，30℃继续培养12-24 h。 从X-gal显色平板上挑取蓝色菌落，抽提菌落中的DNA。 电击法将步骤6中的质粒DNA转化到大肠杆菌MC8菌株中。 利用硝酸纤维膜将转化细胞复印到不含色氨酸的M9培养基上继续培养，挑取生长良好细菌进行培养，碱法小量抽提细菌中质粒DNA。 将步骤8中获得的质粒DNA分别转化到含有诱饵质粒的酵母菌株感受态，在尿嘧啶和色氨酸缺陷的SD培养基平皿上培养3天。 再影印到含有X-gal平板上，30