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油菜下胚轴暗光培养转化 一、步骤流程 1.灭菌 （1）剔除坏种子，将种子倒入无菌培养盒中，75%酒精浸泡种子3-5min，时间不能过长。 （2）加入适量的消毒液HgCl2，灭菌15min，对污染较重的种子，灭菌时间可延长到20min。 （3）消毒后，用无菌水冲洗种子4-5遍。 注意：HgCl2浓度：0.1%-0.2%，用实验室5%的母液稀释即可，用量根据所灭种子的量决定（要完全浸没种子）。 2.播种 （1）用无菌镊子，将灭菌的种子播到M0，每盒20-70粒。 （2）暗处理培养5-6天，温度24℃。 3.摇菌 播种4天后，用AB培养目标菌株，或者5天后用LB培养目标菌株。 用无菌三角瓶（三角瓶中加25-30ml培养液）于28℃，,180-220rpm摇床中。 注意：摇菌前要挑取单菌落，在抗性平板上接种细菌，28℃下培养一天，如果是目标细菌就会在平板上长很多单菌落，此时用10ul枪头吸取该单菌落，再将枪头在上述培养基中反复吸打几次。 4.外植体的制备与侵染 （1）用无菌镊子和解剖刀切取播种6天后的幼苗的下胚轴，每个长度为0.8-1cm，在DM液体培养基中切取效果更佳，切取外植体时尽量一刀垂直切下。 （2）测菌的OD值（LB中0.8左右较好，一般16h即可），将培养好的菌株在离心机6000rpm(4000rpm)离心，10min。倒掉上清，用与菌液相同体积的DM重悬（20mlDM稀释，