原生质体叶肉细胞瞬时表达.docxVIP

原生质体叶肉细胞瞬时表达 生长培养好的试验材料（一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片） 在拟南芥开花前取样（30片叶子左右即可） 切取叶片为0.5-1mm的细条（如果材料能达到每克107个原生质体，10-20片叶子需要5-10mL酶解液） 迅速将切下的样品转到酶解液中，要求完全浸没。 黑暗条件下抽真空30min。 连续酶解，室温下23℃黑暗中静止酶解3h 利用光学显微镜检查原生质体（30-50μm大小） 在过滤前加入等量的W5溶液 洗干净滤网，并用W5润湿，之后过滤 离心100g，1-2min沉淀原生质体，尽可能吸走上清，重复洗2次 重悬原生质体于W5中，保持在2*105个/ml，冰浴30min。 100g离心2min，尽可能吸走上清，利用MMG重悬，浓度约2*105个/ml 加入10μL质粒（1000ng-2000ng）于2ml离心管中 加入100μL原生质体（2*104个），轻轻混匀。 加110μL PEG solution，轻弹使充分混匀 23℃室温孵育30min。 加400-440μL W5混匀，终止反应 100g，2min 23℃离心，去上清，重复洗一次 用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养 20-25℃孵育16h以上 取样制片观察 溶液配制： 酶解液的配制（20ml） 试剂 终浓度 质量/g MES 20mM 0.08528 KOH调pH5.7 D-Manni