SDSPAGE测定蛋白质分子质量.pptVIP

电泳技术理论 一、电泳定义：带电荷的颗粒在电场的作用下向其电性相反的的方向移动。 二、电泳分类： 按电荷量分离 按分子量分离 按等电点分离 三、SDS应用： 1、测分子量 2、分离鉴定 3、双向电泳第二向 SDS测定蛋白质分子质量 一、原理： SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率(Rf)的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出样品的分子量。 相对迁移率和分子量计算 LogM=a-bRf? 相对迁移率(Rf)＝蛋白移动的距离/染料移动的前沿距离 以Rf为横坐标,已知分子量标准蛋白的对数为纵坐标,在半对数坐标纸上绘图,由标准曲线中查出样品分子量。 SDS实验流程（SDS) 电泳技术流程： 制备载体（制胶）→加样→电泳→剥胶→染色→脱色→测定结果(凝胶成像） 常用载体制备： 丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺→（催化剂） →聚丙烯酰胺凝胶 SDS的作用：球形蛋白+ SDS →长棒形蛋白（线状） 样品处理液（巯基乙醇）-S-S- →-HS,SH- 聚丙烯酰胺凝胶作用：分子筛 二、实验方法 实验方法： 样品处理：100uL样品+100uL处理液混匀(沸水浴加热5分钟) 1、灌制分离胶 ： 加入试剂如下：两块14％ 的分离胶，需12mL液体（一组）一份） A液 5.6mL B液 3.0mL 蒸馏水 3.4mL（超纯水） 10％ 过硫酸铵 0.1ml（最后加）（通风柜） TEMED 0.01mL（通风柜） 混合后，用小滴管加入制胶室中，加入高度距短玻板1.5cm左右，缓慢加入蒸馏水压平，聚合约30分钟。 实验设计思路 SDS实验设计： 1、浓缩胶（堆积胶）浓缩效应5% 由三个不连续组成： 凝胶浓度不连续 凝胶缓冲液pH不连续（pH6.8;pH8.8) 凝胶缓冲液负离子不连续：氯离子，甘氨酸根负离子 2、分离胶（14%） 二、实验方法 2、灌制堆积胶： 5% 4mL 待分离胶聚合后，用滤纸吸去上层水，注意不要碰到胶面，然后配制堆积胶，加入试剂如下： A液 0.67 mL C液 1.0 mL 蒸馏水 2.3 mL （超纯水） 10％过硫酸铵 0.03mL （最后加） TEMED 0.005mL 混合后加入制胶室中，加上梳子，待聚合后拔出梳子，将玻板装在电泳槽架上，用小滴管加好电泳缓冲液，赶走气泡。 3、加样15微升左右（微量进样器）（样品及标准蛋白预先用处理液混合沸水浴加热5分钟）。 3、电泳条件：电压150-180伏（时间50分钟左右） 4、剥胶染色：15分钟 5、脱色：20-30分钟换一次脱色液，换4次，再用蒸馏水浸泡10-15分钟。 6、凝胶成像进行分析（生化仪器室465室） 复习与思考： 电泳技术的流程，根据本实验分析实验技术的关键点？ * *