第二章 糖和苷-.ppt

(3) 三氟三氯乙烷法 多糖水溶液 CF3CCl3 1:1 搅拌10min 离心 多糖 蛋白 (4) 三氯醋酸法 多糖水溶液 3%的CCl3COOH, 直到不再继续浑浊为止 5-10oC过夜 离心 多糖 胶状沉淀 1 季铵盐沉淀法 第六节 糖链的结构测定 ※ 主要解决四个问题 ① 单糖的组成；单糖的绝对构型 ② 糖的氧环大小； ③ 糖与糖之间的连接位置和顺序； ④ 苷键构型。 （一）纯度测定方法 1、高压电泳法 ※ 原理：由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢，常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。 ※ 电泳支持体：玻璃纤维丝、纯丝绸布等。 ※ 缓冲液：pH=9-12的硼砂溶液。 ※ 电压：30-50V/cm ※???时间： 30-120min ※??显色剂：p-甲氧基苯胺-硫酸。 ※ 注意：必须使用冷却系统，将温度维持在 0℃,以免烧坏支持体。 ※ 本法常用 2、超离心法 ※ 原理：由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、 大小与形状有关，故将多糖溶液进行密度梯度超离心时， 如果是组成均一的多糖，则应呈现单峰。 ※ 具体做法： 将多糖样品制成1%-5%的氯化钠或tris-盐溶液，接着进行密度梯度超离心，待转速达到恒定后（6000转/min），采用间隔照明法检测其是否为单峰。 3、旋光光度法 在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度达到10%左右，离心得沉淀。上清液再用乙醇使其浓度达到20%-25%左右，离心得到第二次沉淀。比较两次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同则为纯品，否则为混合物。 4、其他方法 如凝胶柱色谱、官能团摩尔比恒定法等。 （二）分子量测定 1、测定多糖分子量物理方法： 沉降法、光散射法、黏度法和渗透压法等。 2、凝胶过滤法简介： 在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定 的关系。采用一系列结构相似的已知分子量的多 糖做标准曲线，进而测定样品多糖的分子量。 ◆ 该法用量小、操作较简便。 3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定 ※ 最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS 4、多糖分子量的测定方法 ① 基质辅助激光解析电离质谱 （MALDI-MS） ② 基质辅助激光解析飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS). （三）单糖的鉴定 1．纸层析 ① 展开系统：常用水饱和的有机溶剂 如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW 正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW ② 展开方式：上行、下行等 ③ 显色剂：可利用糖的还原性或形成糠醛后 引起的一些呈色反应。例如， ※ 邻苯二甲酸苯胺 ※ 硝酸银试剂（使还原糖显棕黑色） ※ 三苯四氮唑盐试剂（单糖和还原性低聚糖呈红色） ※ 3,5-二羟基甲苯-盐酸试剂（酮糖呈红色） ※ 过碘酸-联苯胺（糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显兰底白斑）。 2．薄层层析 ① 采用（硼酸液/无机盐）+ 硅胶 → 制板 ② 吸附剂：硅胶 ③ 显色剂： 除纸层析应用以外，还有H2SO4/H2O或乙醇液、 茴香醛-硫酸试剂、 苯胺-二苯胺磷酸试剂等。 3．气相层析 ① 将糖制备成三甲基硅醚 ② 醛糖用NaBH4还原成多元醇，制成乙酰化物或三氟乙酰化物。 4．离子交换层析 ① 原理： 糖的硼酸络合物可进行离子交换层析 ② 优点：不必制成衍生物，而直接用水溶液 进行分离（与气相比较） ③ 需要仪器—糖自动分析仪 5．液相色谱 ① 填充材料——化学修饰的硅胶 ② 优点：不必制备成衍生物。适合分析对热不稳定的、不 挥发的低聚糖和多糖。 ③ 缺点：灵敏度不及气相层析高。 ◆ 多糖组成的鉴定 1、必要性：低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成、各种单糖之间的比例等。 2、多糖组成鉴定过程：将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比（也可用GC或HPLC对各单糖定性定量分析）。 (四) 单糖绝对构型的测定 GC, HPLC, 手性柱色谱法,手性检测器法, 旋光比较法 （五）糖连接位置的测定 1、化学方法：多采用甲基化法 ①过程：将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相 色谱法对水解产物—甲基化单糖—进行定性和定量分析。 ②甲基化过程：常用箱