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试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1. ?标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用9gl/L NaCl配制成0.1 mg/mL蛋白溶液。
三、器材
试管1.5×15 cm(×6)，试管架，移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
标准蛋白溶液（mL）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
9gl/LNaCl（mL）
0.1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
考马斯亮蓝试剂
4mL
蛋白质浓度ug/ml
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595 nm处比色
绘制标准曲线：以A595?nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取1样品，加4ml考马斯亮蓝溶液，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595?nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(ug/mL)。（超出范围应稀释样品。）
注意事项
在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。
Oorigin做直线图，直线拟合后出如下图，R2=-0.997
Y=0.00687 X + 0.0527，应用公式计算未知样品蛋白质浓度。
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