3-酶联免疫分析检测人甲胎蛋白2015-hw.pptx

酶联免疫分析检测人甲胎蛋白(AFP);酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA);基本原理;测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性； 然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性； 当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速，特异性强。 ;获得待分析物的未标定抗体;概述-甲胎蛋白AFP;目的： ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其他相关生物液体中甲胎蛋AFP?的含量。掌握ELISA的工作原理、适用对象和操作方法。 实验原理：用双抗体夹心法测定标本中人?AFP??水平。 用纯化的人AFP?抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被单抗的微孔中依次加入?标本或标准品?，再与?HRP?标记的?AFP?抗体结合，形成抗体?-?抗原?-?酶标抗体复合物； 经过彻底洗涤后加底物?四甲基联苯胺（TMB?）显色；?TMB?在?HRP?酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色； 颜色的深浅和样品中的??AFP呈正相关。用酶标仪450nm?波长下测定吸光度（?OD?值），通过标准曲线计算样品中人甲胎蛋白（?AFP?）?浓度。 ;试剂盒组成：;样本处理及要求：;4. 细胞培养上清：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分），收集上清。 5.细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml?左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。 6. 组织标本：切割标本后，称取重量。1g组织加入9ml?PBS（浓度为0.1M，pH为7.4的）,充分匀浆，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。 ;1.取出试剂盒，室温放置30分钟。 2.分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（5个浓度）、空白孔??1个）、待测样品组（共12个）。 注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。 3.加样：标准品、待测样品。分别加入40ul。空白调零孔：不加任何试剂。 注意不要有气泡。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 4.温育：用封板膜封板后置37℃温育35分钟。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加300ul洗涤液，静置1分钟弃去，如此重复5次，拍干。 ;6.加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入100ul的HRP标记的抗AFP抗体，空白调零孔除外。37℃温育35分钟。 7.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加300ul洗涤液，静置1分钟弃去，如此重复5次，拍干。 8.显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。轻轻震荡混匀，?37℃?避光显色15分钟( 空白孔需加). 9.终止：加入50ul终止液( 空白孔需加)。终止反应（此时蓝色立转黄色）。 10.读板：以空白孔调零，在450nm波长读取各孔的OD值。测定应在加终止液后15分钟以内进行。 ;注意事项;计算 以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。然后根据样品的OD 值计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。