第五章目的基因的获取.pptVIP

第五章 目的基因的获取 第一节 基因组DNA片段化 1. 优点 二、随机片断化 2. 机械切割法 第二节 化学合成目的基因 1. 磷酸二酯法 （2）合成过程 2.亚磷酸三酯法 二、 化学合成DNA片断的组装 （3）连接酶连成完整双链 2. 互补延伸连接法 三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 DNA合成仪 第三节 PCR扩增获得目的基因 以前讲过关于PCR相关的知识，在这里不在 累述。 第四节 从基因文库、cDNA文库获取目的基因 2. 构建基因文库的载体选用 3. 基因文库构建的一般步骤 （2）载体与基因组DNA大片段的连接 4. 基因组文库的大小 若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106 克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用λ噬菌体载体可 构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所 需要的重组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒将 40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右, 均可满足建库要求。 二、 cDNA文库的构建 4. 构建cDNA文库的一般步骤 （2）mRNA的分离纯化 ② 降解mRNA模板 ③ cDNA第二链合成 去掉发卡结构 b.置换合成法： 原 理： 以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产