RNA干扰技术课件.ppt

RNA干扰技术;RNA干扰：一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。 ;2006年的诺贝尔生理学奖获得者：;RNAi----- RNA interference;转录后沉默;RNAi 研 究 史; 牵牛花（petunias） 协同抑制现象cosuppression，;线虫的RNAi;RNAi 应答的基本特征:;RdRP ----- 依赖RNA的RNA聚合酶;RNA-directed RNA polymerase;哺乳动物细胞中的RNA干扰;研究发现不超过30个碱基的双链RNAs并不会激活PKR激酶途径; Degradation of the target mRNA (引起靶标mRNA的降解), Inhibition of translation of the target mRNA (抑制靶标mRNA的翻译), Silencing the gene transcription from the target promoter (引起靶标启动子的转录沉默).; Dicer: an RNaseIII-like multidomain ribonuclease that first processes input dsRNA into small fragments called short interfering RNAs (siRNAs) or microRNAs (miRNA). Dicer then helps load its small RNA products into RISC. RISC (RNA induced silencing complexes) (RNA诱导的沉默复合物): a large multiprotein complex that direct the bound siRNA or miRNA to its target and inhibit the target gene expression.;RNAi 机制 模式图; 确定目的基因  根据相对应的核酸序列设计出 siRNA的序列  获得siRNA  用siRNA转染细胞  分析RNA干扰的效果;siRNA的一般结构： 哺乳动物：21-23bp dsRNA 非哺乳动物：长片段dsRNA;如何选择siRNA靶位点：;;补充：; 双链 RNA合成 非特异siRNA合成 ;siRNA construction procedure;DuraScribe? T7 Transcription Kit ;非特异性siRNA合成 ----ShortCut RNAi Kit ;用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA; siRNA表达载体在细胞中表达siRNAs 以PCR制备的siRNA表达框进行体内转录 利用病毒系统实现体内表达siRNA ;siRNA表达载体;The DNA vector-based RNA interference (RNAi) technology;BD? Knockout Adenoviral RNAi Systems;siRNA表达载体;Luciferase;siRNA表达框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 ;总结5种不同的制备siRNA的方法。;Nitrite amount ;SiRNA 的 转 染;转染方法： 1 磷酸钙共沉淀; 2 电穿孔法; 3 DEAE-葡聚糖 4 机械法 5 阳离子脂质体试剂;Fig 3. Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA (in situ hybridization in embryos) (胚胎的原位杂交).;RNAi的应用;MicroRNAs ;MicroRNA (miRNA): A New Class of Small RNA Molecules; miRNAs的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。 miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生(Kim, 2005)。;What is miRNAs;;