第七章抗原抗体反应及应用2011.pptVIP

第七章抗原抗体反应及应用 第一节 抗体的制备 克隆化 将许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个细胞克隆的过程。 有限稀释法 将混合细胞稀释后分装于培养板中，使培养板的大部分孔中只有一个细胞的方法。 重组抗体 1、嵌合抗体（Chimeric antibodies） 将鼠Ig可变区基因，与人Ig恒定区的基因连接，插入适当质粒，构建鼠-人嵌合的重链和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞，表达鼠-人嵌合抗体. 四、催化性抗体 有催化活性的抗体 五、抗体在抗肿瘤治疗中的应用 第二节 抗原抗体反应原理 一、抗原抗体反应的原理 抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 因抗体主要存在与血清中，故又称为血清学反应。 二．抗体与多价抗原结合的浓度带现象 抗体与单价抗原形成复合物----可溶性 抗体与多价抗原形成的复合物----形成沉淀 带现象：如抗原或抗体过剩，则抗原与抗体仅能形成小分子的复合物，不出现肉眼可见的反应。 前带(pro-zone)现象 后带(post-zone)现象 三．交叉反应 四、抗原、抗体反应的一般规律 （1）特异性 （2）可逆性 Ab + Ag Ab-Ag 复合物 （3）定比性:只有当两者比例合适时，才会出现可见反应。 （4）阶段性 1、初级反应阶段：抗原与抗体发生特异性结合。 反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。 2、次级反应阶段：可见反应阶段，抗原抗体复合物进一步交联和聚集，出现可见的沉淀。 反应慢，往往需要数分钟至数小时。 第二阶段受多种因子影响:如抗原抗体的比例、pH、温度、电解质和补体等 （5）条件依赖性 最佳条件一般为 pH＝6－8，温度为 37－45℃，适当振荡，以及用生理盐水作电解质等。 第三节 常见免疫分析方法 免疫学技术的发展趋向 特异性、敏感性、精密的分辨能力、高水平的定位、试验电脑化，反应微量化，方法标准化、试剂商品化、方法简便快速。 用单克隆抗体提高特异性；用各种标记技术提高敏感性；结合各种电泳技术提高对抗原分析的分辨能力，结合激光共聚焦显微镜、电子显微镜进行亚细胞水平、染色体、甚至分子水平上的定位；放射免疫测定、免疫酶标抗体测定，在专门仪器上配备有电脑和分析软件，使试验操作和试验结果处理和记录自动化；以免疫学技术为基础的蛋白质芯片技术，使血清学检测技术向更加微量化、自动化和规模化集成方向发展。利用基因工程重组抗原和单克隆抗体研制各种诊断试剂盒和试剂纸条，其中备有各种标准抗原和参考血清，使其标准化和商品化，是血清学试验的一个重要发展趋向，将大大促进血清学技术的普及和应用。 1、直接凝集反应(direct agglutination) 颗粒性抗原与相应的抗体结合呈现的凝集现象。 如ABO血型的测定，细菌凝集试验。 2、间接凝集反应（indirect agglutination） 可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关的微球载体上，形成致敏颗粒，与相应的抗体或抗原在电解质存在的条件下进行反应，出现凝集。 是指可溶性抗原与相应抗体在合适的电解质存在下，出现肉眼可见的沉淀现象。 1、单向琼脂扩散试验 2、双向琼脂扩散试验 3、火箭电泳 4、对流免疫电泳 1、单向免疫扩散(single immuno diffusion) 放射免疫分析是在体外条件下，由非标记抗原(待测抗原)与定量的标记抗原对限量的特异性抗体的竞争性抑制的反应。 将Ag或Ab吸附在固相表面，Ag与Ab反应后，将固相与液相分离除去游离的Ag或Ab，结合的Ag或Ab上标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物。 常用来标记的酶是辣根过氧化酶，其底物是联苯二胺（DAB，无色），酶催化的产物为黄色。 特点：最常用，可用于测定抗原，也可用于测定抗体；灵敏度高（10-9-10-12克）；特异性强；操作简便。 有直接法、间接法、夹心法等。 3、免疫电泳（immuno electrophoresis） 蛋白质电泳与免疫扩散相结合的方法。 （1）火箭电泳：单扩+电泳 （2）对流免疫电泳：双扩+电泳 特点：灵敏度高，时间短。 （1）火箭电泳 抗体混于琼脂凝胶中制板，抗原加入小孔中，电泳后，沿电泳方向形成火箭型沉淀线。 （2）对流免疫电泳 抗体和抗原分别加入不同小孔中，电泳后，在两个孔之间形成沉淀线。 电场作用 电渗作用 三、免疫标记 Ab + Ag Ab-Ag 复合物 (可见或不可见) 　 荧光素 　酶 放射性同位素 生物素-亲和素 1、放射免疫分析（radio immunoassay