Q_HDS069-2019超浓缩冻干EM菌粉.pdf

Q/SXS 运城海达生物科技有限公司企业标准 Q/HDS069-2019 超浓缩冻干EM菌粉 2019-04-16发布 2019-04-16实施 运城海达生物科技有限公司 发 布 前 言 本标准由运城海达生物科技有限公司提出。 本标准由运城海达生物科技有限公司起草。 本标准主要起草人：卫海明 1、范围 本标准规定了EM菌粉的形态学鉴定、生化鉴定以及PCR、荧光PCR检测鉴定方法。 本标准适用于EM菌粉检测鉴定。 2、规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本使用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规则和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T230 临床诊断中聚合酶链反应 （PCR）技术的应用。 3、术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 EM菌粉 革兰氏阳性杆菌，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，内生孢子，接触霉阳性，发酵葡萄糖产酸，水解淀 粉，不水解马尿酸盐，可还原硝酸盐，水解酪素，在55℃可生长的一群芽孢菌。 4、人员防护 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测，所有培养物应小心处置。在对微生 物菌剂的取样和检测过程中，按照GB19489 中的生物二级防护的规定执行。 5、主要试剂盒培养基 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水应符合GB/T6682。所有试剂均可用无DNA 酶污染的容器分装。 5.1 营养琼脂：蛋白胨10g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，1L 蒸馏水，加热煮沸到完全 溶解，调节PH7.3±0.1，121℃灭菌15min。 5.2 营养肉汤：蛋白胨10g，牛肉浸膏3.0g，氯化钠5.0g，1L 蒸馏水，加热煮沸到完全溶解，调节 PH7.3+0.1，121℃灭菌15min。 5.3TE 缓冲液：10mmol/LTris,1mmol/L EDTA,PH8.0。 5.4 10×PCR 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL(PH8.4)，500mmol/L 氯化钾 （KCL），15mmol/L 氯化镁 （MgCl )。 2 5.5TBE：54gTris,27.5g硼砂，800ml 去离子水溶解，20ml 0.5mol/LEDTA(PH8.0)定容至 1L。 6、主要仪器和设备 6.1 天平：精度为0.1g。 6.2 恒温培养箱：30±1℃。 6.3 恒温水浴锅 6.4 离心机：转速 12000r/min 以上 6.5PCR 仪 6.6 荧光 PCR 仪 6.7 微量移液器和灭菌吸头：10μl、20μl、200μl、1000μl。 7、样品制备、培养 -1 -10 以无菌操作将检样25g(ml)用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成10 ～10 的稀释液，充分混匀。 选择适宜的2个～3个连续稀释度的菌液1ml 于灭菌平皿内，将冷却到40℃～50℃的营养琼脂倒入 平皿，轻轻混匀，制成混板，每个稀释度做连个平行样。待培养基凝固后倒置于30℃±1℃恒温培养 箱内培养24h～48h。挑取平板上3个～5个无色透明菌落进行形态学鉴定并挑单菌落转营养肉汤30℃ ±1℃恒温培养箱内增菌培养18h～24h 后进行生化鉴定。 8、形态学及生化鉴定 8.1 革兰氏及芽孢染色 将第7 章中平板上的菌落做成图片进行革兰氏和芽孢染色，镜检。 8.2 生化鉴定法 取菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每管100μl。 8.3 光合细菌粉形态学及生化特征 光合细菌粉为革兰氏阳性杆状细菌，细胞直径＜1μm，很少成链，鞭毛侧生，内生孢子，