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荧光成像的原理与方法 荧光成像在基因组学和蛋白质组学等生物学领域应用中的独特优势： 高灱敏度：灱敏度进超比色法，在大部分应用中其灱敏度近乎放射性同素。 多组样品一次成像：将不同样品（如：对照、处理）通过不同发射波长的荧光素标记 （如Cy3 或 Cy5 等 ）可以同 时检测多样品荧光信号。 稳定性高 ：较放射性同位素相比，荧光素标记的抗体、杂交探针、PCR 引物等的信号稳定性优势明显，可稳定存在 数月以上 ，这使需要大规模标记并多阵列之间的标准化比较成为了可能。 低毒性成本低：多数情况下，荧光标记和检测的全过程试验用手套即可对实验者提供足够的保护。易于运输和实验 后处理，多数情况下实验成本低于放射性同位素。 商业可获得性：许多重要的荧光标记型生物大分子如各种单抗、多抗、CAT等及荧光标记用试剂盒都可以方便获得, 同时一些公司提供荧光标记的外包服务。 荧光信号的产生及信号捕获原理 ： 荧光物质被特定外界能量激发 （如激光等高能射线），引起其电子轨道向高能轨道跃迁 ， 并最终释放能量回归基态的过程中会产生可被检测的荧光信号 。当然不是所有的物质都能被激发产生荧光，只有当 该物质与激发光具有相同的频率并在吸收该能量后具有高的荧光效率而非将能量消耗于分子间碰撞过程中，其荧光 信号才可被光学设备所检测 （Fig.1）。 TM Fig.1 ①激发能②无辐射弛豫能③荧光发射能 。三种荧光素（绿色：fluorescein ；黄色：DNA-bound TOTO ；红色： DNA-bound EB）的激发光波长(a)和发射光波长(b)。 荧光成像系统的组件和工作原理 ： 荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系的 ，这是荧光成像系统应 用于生物学研究的理论基础 ，激光扫描系统的性能指标主要有：系统分辨率、线性范围、均一性、灱敏度。 为了实现荧光信号的激发、捕获和放大的检测过程，按照顺序荧光成像系统主要包括以下组件：激发源 （Excitation resource）、激光传输组件（Light delivery optics）、荧光收集组件（Light collection optics）、发射 滤镜（Emission filter）和信号检测放大组件（Detection and amplification）（Fig.2）。在荧光成像系统工作的过程 中，每个组件的性能都关系着最终荧光信号的收集和检测结果。 、 Fig.2 荧光成像系统的基本光学组件和工作原理示意图 1. 现有的激发源主要可分为两大类即：宽波长光源 ，如紫外、氙灯等 ；单波长非连续光源 ，如激光光源。前者 主要应用于分光光度计和照相成像系统，可直接照射被检样品。 2. 激光传输组件（Light delivery optics）激光光源还需要一系列透镜和反射镜来导引其完成激发的过程。需要 指出的是波长光源也可以通过光栅和滤镜的作用变为窄波长光源。激光传输组件主要在这一过程中起作用。 用以将所需波长的光线导向样品，从而保证激发光的单一性。 3. 荧光收集组件（Light collection optics） 高质量的光学收集组件应包括透镜、反射镜和滤镜等，负责拟 合不同波长的发射光、保证线性关系和透过性。 4. 发射光过滤组件主要通过滤镜来起到收集和过滤杂信号的作用 。 5. 信号检测、放大和数字化组件：为了检测荧光光能信号并将其放大、转化成电信号从而迚行定量分析，光电 倍增管（PMT）、电荷偶联器（CCD）常被人们所选择。该组件的性能通常通过数字化分辨率来表示,它是用来描 述在同样信号强度条件下区分不同两个信号的能力，即人们常说的比特（bit），现多为 8-bit，12-bit 和 16-bit （分 别对应为 256 灰阶、4096 灰阶和 65536 灰阶 ）。 激光光源的选择 现代荧光成像系统的光源选用最多的有两种即：激光 （Laser）光源和发光二极管 （LED）光源。两者各有各自 的优势和应用范围，客户应根据实际应用领域选择更合适的光