基因工程综合实验教学大纲.docVIP

《基因工程综合实验》教学大纲 学时：12学时 学分： 课程性质：必修 实验个数：1个 适用专业：生物技术专业、生物科学专业、生物技术及应用专业 大纲执笔人：马丽 大纲审定人：王洪凯 一、课程的性质与任务 基因工程是生物工程的主干课程之一，是一门重要的专业课，它构成生物工程的基础和核心。通过本课程的实验使学生掌握基因的转化、基因的扩增和重组体的筛选与检测技术。通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握基因工程的实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作奠定基础。 二、实验的目的与要求 本课程的目的是培养高年级本科生进行基因操作的能力。本实验课在方法上，力求经典，内容涵盖基因工程操作的基本过程。通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法。教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学报告，为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。 三、实验项目及内容提要 序号 实验项目 学时 必开 选开 试验类型 内容提要 基本 综合 设计 1 大肠杆菌的培养和碱变性抽提法制备质粒DNA 6 √ √ 培养大肠杆菌细胞至生长对数期，并用煮沸法提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳验证。 2 大肠杆菌感受态的制备 6 √ √ 制备大肠杆菌DH5感受态细胞，当OD值达到要求后离心收获细胞，加入CaCl并置冰浴中过夜。 3 质粒DNA转化大肠杆菌及转化结果的检测 6 √ √ 应用制备好的大肠杆菌胞，在42℃ 4 农杆菌介导的植物基因转化及检测 12 √ √ 用农杆菌LBA4404，采用叶圆片法转化烟草，经选择培养，获得转基因植株。 四、实验内容安排 实验一 大肠杆菌的培养和碱变性抽提法制备质粒DNA 目的与要求 通过本实验学习熟悉细菌培养收集的时期。掌握碱变性抽提质粒DNA的实验原理、步骤及各试剂的作用。了解质粒的电泳和吸光值等检测方法。 二、实验原理 在 pH12.0碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 三 、实验内容 1、大肠杆菌的培养与菌体收集。 2、碱变性抽提质粒DNA及电泳检测。 实验二、大肠杆菌感受态的制备 目的与要求 通过本实验要求掌握感受态细胞的制备原理。熟悉感受态细胞的制备过程。了解影响感 受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。 二、实验原理 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42 三、实验内容 1、感受态细胞的制备基础知识及方法简介 2、CaCl2法制备DH5或JM109感受态细胞，计算转化效率 3、pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞 实验三、质粒DNA转化大肠杆菌及转化结果的检测 目的与要求 通过本实验的学习掌握热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。 二、实验原理 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。 大肠杆菌在 0℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 1、介绍抗生素筛选转化子的理论基础 2、pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞 实验四、农杆菌介导的植物基因转化及检测 目的与要求 本实验的目的是学习和掌握根癌农杆菌介导植物基因转化的基本原理，叶盘转化法 的操作过程。了解转基因植株检测的几种方法及实际操作过程中应注意的事项。 二、实验原理 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciences），又称根癌土壤杆菌，是土壤杆菌属（Agrobacterium）的一种革兰氏阴性细菌，能浸染多种双子叶植物和少数单子叶植物。根癌农杆菌含有Ti质粒(tumor inducing plasmid)。Ti质粒是双环DNA、